转红色荧光蛋白基因唐鱼的遗传分析和生物学研究

转红色荧光蛋白基因唐鱼(Tanichthys albonubes)测交获得实验鱼,以表达红色荧光蛋白为表型性状,采用点杂交和遗传学分析相结合的方法,研究外源基因的遗传传递规律,并对转基因唐鱼和非转基因唐鱼的生长和繁殖等方面进行了比较。结果显示:测交后代表型的分离规律基本符合经典的孟德尔单显性基因遗传模式,外源基因属于单位点整合,测交后代中没有发现沉默整合个体;实验鱼的生长和可量性状对比实验表明,转基因唐鱼和非转基因唐鱼在仔鱼期到性成熟之间,生长速度无显著差异,性成熟个体的外部形态除体色外也无差别,繁殖力方面基本无显著差异。本研究结果表明了培育转红色荧光蛋白基因唐鱼纯系的可行性;同时在生长、繁殖方面的研究结果为评价转基因唐鱼的生态安全奠定了基础。

RNA干扰技术在鱼类中的研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是真核生物体内利用双链RNA(double strand RNA,dsRNA)诱导同源靶基因的mRNA特异性降解,从而导致转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing,PTGS)的现象。RNAi主要通过核酸酶Dicer切割dsRNA生成21～23nt的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA),继而由siRNA识别并靶向降解同源靶基因mRNA,从而抑制靶基因的蛋白表达。文章综述了RNA干扰技术的原理、siR-NA的制备及在鱼类中的研究进展。

鱼类标志技术的研究进展

鱼类标志技术在鱼类遗传育种和引种驯化中得到广泛应用,同时它也是一种研究鱼类分布、种群密度、洄游和鱼类资源等的重要方法。综述了鱼类标志技术的种类、优缺点及研究应用等,以期推动鱼类标志技术的发展。

大口黑鲈肝脾肿大病病原研究

为了查明2009年10月广东省佛山地区养殖大口黑鲈（Micropterus salmoides）中暴发的传染性疾病的病原，对病鱼的肝脏、脾脏和腹隔膜进行切片电镜观察，发现细胞质中有大量病毒颗粒，切面为六角形，直径约145～150nm，病毒为二十面体对称结构、无囊膜、似虹彩病毒的病毒粒子。用除菌的病鱼组织滤液感染健康大口黑鲈，被感染鱼死亡率达90％以上。根据已知虹彩病毒主要衣壳蛋白（MCP）基因序列设计特异引物，提取人工感染发病鱼的肝脏、脾脏、肾脏组织的DNA进行PCR扩增，将扩增片段进行序列测定与分析，结果表明该序列与已报道的鳜（Sinipercachua~0传染性脾肾坏死病毒（InfectiousSpleenandKidneyNecrosisVirus，ISKNV）MCP基因同源性为98％。电镜观察和MCP基因测序分析结果显示，该病毒的分类地位为虹彩病毒科（Iridoviridae）细胞肿大病毒属（Megalocytivirus）。

微卫星标记对中国引进加州鲈养殖群体遗传多样性的分析

为了解我国引进加州鲈养殖群体的种群遗传结构和种质资源现状,本文发展了加州鲈的微卫星标记。用磁珠富集法获得加州鲈微卫星标记267个,设计并合成了85对微卫星引物对加州鲈的基因组进行遗传多样性分析,从中筛选出18对并从网上查询获得3对共21对引物对加州鲈的基因组DNA进行扩增。PCR扩增产物在8%的聚丙烯酰胺凝胶中分离,硝酸银染色,经紫外成像后对电泳条带进行统计分析。计算得到三个群体的平均等位基因数分别为2.3、2.3和2.1;多态信息含量(PIC)为0.0906—0.7480;平均杂合度观测值分别为0.384、0.396和0.356;杂合度期望值为0.375、0.403和0.368。统计结果初步表明3个不同群体平均杂合度处于中等偏低水平,遗传多样性不高。

大口黑鲈早期生长发育规律的研究

为了研究大口黑鲈Micropterus salmodies早期生长的发育规律,选用8个全同胞家系的大口黑鲈,每月从每个家系中随机选取30～40尾,对其体重和体长进行测量。运用Gompertz、Logistic和Von Bertalanffy3种非线性模型对大口黑鲈体重和体长的生长进行非线性曲线拟合分析,同时利用幂函数方法对大口黑鲈体重与体长的生长关系进行分析。结果表明:3种非线性模型均能较好的模拟大口黑鲈体重和体长的生长,而Logistic模型拟合效果更佳;进一步分析体重和体长的最佳拟合参数,发现体重和体长的拐点月龄分别为5.77月龄和4.95月龄,拐点处体重和拐点处体长分别为146.35 g、13.75 cm;幂函数方程能很好地拟合大口黑鲈体重和体长之间的关系,其方程为W=0.076L2.650(R2=0.998)。研究结果可为大口黑鲈养殖中的饲养管理和品种选育提供参考。

大口黑鲈IGF-I基因内含子1、3和4序列多态性研究

根据大口黑鲈IGF-I基因的cDNA序列设计引物,克隆IGF-I基因内含子核苷酸序列,采用PCR产物直接测序方法,在中国养殖群体和美国野生群体中筛选IGF-I基因内含子上的多态位点。应用RFLP、CRS-RFLP和SSCP技术建立多态位点的检测方法,同时比较分析其中4个多态位点在两个群体中基因频率分布。结果表明:(1)IGF-I基因内含子1、3和4序列长分别为1 317 bp、712 bp和1 941 bp;(2)在3个内含子上共发现7个多态位点,其中在内含子1的208和1070位为G-A突变;内含子3的第40个碱基为一个"A"的插入-缺失突变,第307位为C-T突变,683位是G-A突变;内含子4上的696碱基处有一个20 bp的插入-缺失突变,在1 563位为G-A突变,表明大口黑鲈IGF-I基因序列上存在较多的SNPs;(3)内含子1上SNPG1070A的A等位基因能为Hind III限制性内切酶识别,采用RFLP技术分型。根据内含子1上SNP G208A侧翼序列,设计错配引物,使错配碱基和A等位基因共同形成TaqI酶切位点,建立CRS-RFLP检测方法。内含子4上SNP G1563A采用SSCP检测方法,同时对内含子4上的插入-缺失突变进行PAGE电泳分型。试验结果显示,RFLP、CRS-RFLP和SSCP三种SNP检测方法简单易行,适于在水产动物SNP标记研究中推广应用;(4)在中国养殖群体中,只有内含子1上的SNP G1070A具有多态性,其它3个多态位点只在美国野生群体中存在多态,证实中国养殖群体的遗传多样性相对较低。

中国养殖大口黑鲈的亚种分类地位探讨

采用形态学方法和微卫星特异分子标记两种方法鉴定了中国养殖大口黑鲈Micropterus salmoides的分类地位。结果表明：中国养殖大口黑鲈的侧线鳞为58～68片，肋骨数为15对，这与原产地大口黑鲈北方亚种较一致；选择鉴别两亚种的特异性微卫星标记（Md06、Msal21）对中国养殖大口黑鲈进行特异性扩增，并以原产地大口黑鲈佛罗里达亚种和大口黑鲈北方亚种样品作为对照，结果为中国养殖大口黑鲈的特异性扩增片段大小和原产地北方亚种扩增条带相同。综合形态学和分子标记两方面的结果，表明中国养殖大口黑鲈应属于大口黑鲈北方亚种Micropterus salmoides salmoides。

转基因水生动物的应用研究

1966年Lin首次报道了将外源基因注入小鼠卵中的显微注射方法。1982年诞生了首例转基因动物——转基因小鼠。1984和1985年转基因虹鳟和鲫鱼研究获得成功。经过二十多年来的努力，转基因水生动物尤其是转基因鱼的研究有了长足的发展。转基因水生动物研究可分为基础研究及应用研究两方面。基础研究方面，与哺乳类相比鱼类产卵量大、胚胎经基因转移操作后不需放回母体内培育，且携带的与人类相关的病原体较少，因此硬骨鱼类成为脊椎动物生物学研究的模型动物，通过转基因以研究基因的结构与功能、基因的表达调控、发育生物学、生理学、遗传学等。应用研究方面，通过转基因技术培育经济性状得到改善的水生动物新品种，以提高其生长速度和饲料转化率，改善品质，控制繁殖或性别表型，增强对病原体的抗性、对环境因子的耐受性或生存能力等；通过转基因使水生动物作为生物反应器表达生产重要药物或生物活性物质；通过转基因改变观赏鱼的表型提高其观赏价值等。有学者预测鱼类将会是首先进行商业性应用的转基因动物，也有学者预测转基因鱼进入市场有望在我国首先实现。笔者对转基因水生动物应用研究方面的进展及存在问题作一综述。

草鱼MyoD基因原核表达研究

采用PCR方法对草鱼MyoD基因开放阅读框进行了改造扩增,构建了草鱼MyoD基因的原核表达载体pBV 220-M yoD,并进行了初步的原核表达研究。结果表明,构建的原核表达载体pBV 220-M yoD含有草鱼My-oD基因完整的开放阅读框;该原核表达载体表达产物的相对分子质量为34 ku,其表达产物占全菌蛋白的10.8%,表达量较低。

大口黑鲈hepcidin真核表达载体构建及表达的初步研究

将大口黑鲈(Micropterus salmoides)抗菌肽hepcidin cDNA定向插入真核表达载体pPICZαA,通过SacI酶切线性化重组表达质粒pPICZαA-hepcidin,电转化毕赤酵母P.pastoris GS115,PCR扩增筛选,甲醇诱导表达等进行了hepcidin真核表达工程菌株的构建及诱导表达。结果显示:hepcidin cDNA成功插入表达载体pPICZαA,并整合到酵母基因组中;经甲醇诱导,RT-PCR检测显示hepcidin cDNA在酵母细胞中成功转录。

基于线粒体D-loop区探讨我国养殖大口黑鲈的分类地位和遗传变异

对大口黑鲈国内养殖种群(G)和北方亚种(N)、佛罗里达亚种(F)两个野生种群共23个个体的线粒体DNA D-loop区序列进行分析,探讨国内养殖大口黑鲈(Micropterus salmoides)的分类地位和遗传变异。D-loop区序列分析结果表明,共检测到73个变异位点,总变异率为9.0%。三群体间没有共享单倍型,群体G的5个个体含2种单倍型,群体N的11个个体含9种单倍型,群体F中每个个体均为一种单倍型。对三个群体间的遗传距离分析表明,养殖群体与北方亚种野生群体的遗传距离为0.009,与佛罗里达亚种野生群体的遗传距离为0.053,表明国内养殖的大口黑鲈在分类上属于北方亚种,分子系统进化树的进一步分析结果与其一致。群体N、F和G的核苷酸多样性指数(π)依次为0.008 2,0.013和0.000 5,单倍型多样性指数(h)分别为0.946,1.000和0.400,显示出养殖大口黑鲈群体的遗传多样性相比国外野生群体有明显下降,有必要开展大口黑鲈的遗传改良研究,提高其种质质量。

三个不同养殖群体金鱼遗传多样性的RAPD分析

采用随机扩增多态性DNA（RAPD）方法对金鱼3个不同地区养殖群体一天津塘沽（TJ）、江苏苏州（JS）及福建福州（FZ）群体各20ind的DNA多态性进行了分析。在事先优化的反应条件下，所使用的100个随机引物中，有14个引物扩增出清晰稳定的片段，共计103条，大小在200～2500bp，其中多态性片段27条。金鱼总的DNA多态位点百分率为26．21％。数据分析结果显示，3个金鱼群体内遗传多样性偏低，遗传相似度为0．9519～0．9785。金鱼3个群体总的Nei基因多样性指数为0．1061，Shannon信息指数为0．1547。金鱼3个群体间平均遗传距离为0．0375，基因分化系数Gst为0．243，表明3个养殖群体间产生了一定程度的遗传分化。UPGMA法和NJ法的聚类分析显示，两者结果一致。TJ群体和JS群体优先聚类，再与FZ群体聚类。

大口黑鲈选育群体遗传多样性的AFLP分析

采用AFLP技术对大口黑鲈(Micropterus salmoides)F3、F4代选育群体的遗传结构进行分析,并计算2个选育群体和一个对照养殖群体的遗传多态度、遗传距离及分化系数。结果显示,8对AFLP引物共扩增到262条带,其中多态性条带有80条,每对引物检测到的多态性条带在5～13之间。F3、F4代选育群体和对照养殖群体的多态性位点比例分别为29.36%、29.20%、30.29%。Shannon多样性指数分别为0.2017,0.1955,0.2042。结果表明,选育群体相较于对照养殖群体多态位点比例和遗传多态度均有所下降。群体间的遗传变异平均为0.0752,由此可见,92.48%的遗传变异来自于群体内,而只有7.52%的遗传变异来自于群体间,这初步显示了大口黑鲈在遗传上的稳定性,群体尚具有一定的选育潜力,可继续进行人工选育。

大口黑鲈选育效果的初步分析

通过选择培育获得大口黑鲈群体选育子三代,对其选育效果进行初步评价。实验数据分析表明,经过三代的选育,大口黑鲈2个选育组在体长、体高和体重上均大于对照组,且差异极显著(P<0.01),选育组1和2的日增重率分别比对照组提高了25.32%和23.42%,平均每代的选育效应分别为8.44%和7.81%,而体重变异系数分别是26.8%和20.2%,相比对照组分别降低了9.8%和21.1%。试验结果表明,大口黑鲈的选育效果明显,F3代的生长性能有了显著性的提高,个体之间的生长速度更加趋于一致,同时,F3代仍具有较大的选育潜力,可继续对其进行选育。该研究为进一步通过选择育种培育大口黑鲈优良品种(系)奠定了基础。

转红色荧光蛋白基因唐鱼的繁育和养殖技术

转红色荧光蛋白基因唐鱼(转基因唐鱼)为2003年中国水产科学研究院珠江水产研究所自主研发的转基因观赏鱼。结合养殖转基因唐鱼的经验,对转基因唐鱼水质条件、营养需求、人工繁殖、受精卵孵化、幼体培育以及日常管理等方面作了详细介绍,旨在为转基因唐鱼的人工繁育和大规模推广提供基础资料。

大口黑鲈形态性状对体重的影响效果分析

对大口黑鲈全长、体长、体高、体宽、眼间距、头长、吻长、尾柄长、尾柄高和体重共10个性状进行测定,运用相关分析、通径分析和多元回归分析,剔除与体长存在显著共线性的全长、体高、头长,尾柄高及回归方程中不显著的吻长和尾柄长,计算以体宽、体长、眼间距3个形态性状为自变量,体重为依变量的相关系数、通径系数、决定系数及相关指数,定量分析大口黑鲈形态性状对体重的影响效果。结果显示,3个形态性状与体重的相关系数(0.942,0.979,0.928)均达到极显著水平(P<0.01);通径分析中,3个形态性状对体重的通径系数亦达到极显著水平(P<0.01),它们是直接影响体重的重要指标,其中体宽(P4=0.599)对体重的直接影响最大。所选形态性状与体重的相关指数R2=0.980,说明所选性状是影响体重的主要形态性状。应用逐步多元回归分析建立了以体重为依变量(Y),体宽(X4)、体长(X2)和眼间距(X5)为自变量的回归方程:LgY=1.065+0.765 LgX2+1.441 LgX4+0.543 LgX5。以上形态性状对体重影响效果相关数据的获得为大口黑鲈选育测量指标的确定提供了理论依据。

罗非鱼MC4R基因克隆及与其生长相关的SNPs位点

黑素皮质素受体-4(Melanocortin receptor-4,MC4R)是5种已发现的黑素皮质素受体家族成员之一,属于跨膜G-蛋白耦联受体超级家族,对于调节动物的采食量、体质量及能量稳态有着重要的作用。本研究采用基因组步移技术获得了尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)MC4R基因组DNA序列。该基因全长2547bp,其中5′侧翼序列长为1481bp,3′侧翼序列长为82bp,编码区序列长为984bp,只有1个外显子。采用PCR产物直接测序法、PCR-RFLP和CRS-PCR技术对尼罗罗非鱼MC4R基因启动子和外显子区域进行了SNPs位点的检测和分型,结果共检测到5个SNPs位点(-G1000C、-T974A、C276T、C561T和C708T),其中外显子上的3个SNPs位点均为同义突变。利用一般线性模型分析5个SNPs位点与尼罗罗非鱼生长性状的关系,结果表明,5个SNPs位点不同基因型之间体质量均值差异最大值分别为9.5%、23.2%、14.4%、18.6%和13.5%,没有达到显著水平(P>0.05)。将5个SNPs位点不同基因型组合成7种双倍型(去掉频率小于3%的组合),关联分析表明,在体质量和体长这2个主要生长性状方面,双倍型D4与D1、D3、D6存在显著性差异(P<0.05),双倍型D2与D3、D6也存在显著性差异(P<0.05)。因而可以考虑将MC4R基因作为影响罗非鱼体质量等生长性状的候选基因,应用于罗非鱼分子标记辅助育种。

大口黑鲈肌肉生长抑制素基因单核苷酸多态性位点的筛选及其与生长性状关联性分析

采用PCR-SSCP和PCR-RFLP技术对大口黑鲈肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因全序列进行了SNPs位点筛选和分型,共筛选到2个单核苷酸多态性(SNPs)位点(C-1453T和T+33C),其中C-1453T位于启动子E8box和Octamer(+)调控元件之间的区域,T+33C的突变位于第一外显子区域,属于同义突变,氨基酸没有发生变化;利用一般线性模型分析单标记位点与大口黑鲈生长性状(体重、体长、体高、体宽和眼间距)相关性,均未达到显著水平(P>0.05)。将2个SNPs位点不同基因型组合成6种双倍型(去掉频率小于3%的组合),关联分析表明,双倍型D2在体重、体长、体高、体宽和眼间距的均值均高于其它双倍型,而双倍型D5在体重、体长、体高、体宽和眼间距的均值均低于其它双倍型,双倍型D2与D5之间在5个主要生长性状均存在差异显著(P<0.05),推测双倍型D2对生长性状起正相关,而双倍型D5与大口黑鲈的生长性状呈负相关,因此推断MSTN基因突变位点双倍型D2与D5可作为大口黑鲈生长性状的两个标记位点,用其分子标记位点来辅助大口黑鲈育种工作以期加快育种进程。

大口黑鲈病毒性溃疡病病原的分离和鉴定

对广东省佛山地区2008年夏季高温时期暴发的大口黑鲈溃疡病的病原进行分离，从患病鱼的病灶肌肉组织中分离到5株嗜水气单胞菌，人工感染健康大口黑鲈，均末出现溃疡暴发病的典型症状——病鱼体表大片溃烂，裸露肌肉坏死并有出血，尾鳍、胸鳍和背鳍基部红肿溃烂。制备病灶肌肉组织的除菌过滤液，背部肌肉注射感染健康大口黑鲈，7d后出现典型的溃疡病症状。取自然发病鱼和人工感染的患病鱼病灶肌肉组织制作超薄切片，经电镜观察，均发现组织中有大量病毒颗粒，病毒粒子有囊膜，呈六角形，为正20面体对称结构，大小约为145．5nm。根据已知虹彩病毒主要衣壳蛋白（MCP）基因序列设计特异引物，提取人工感染发病鱼病灶肌肉组织的DNA进行PCR扩增，将扩增片段进行序列测定与分析，结果表明该序列与已报道的虹彩病毒MCP基因有着较高同源性（39．5％～100％）。从电镜观察和MCP基因测序分析结果确认该病毒为虹彩病毒科蛙病毒属中的一种病毒，与国外报道的大口黑鲈病毒（LMBV）在分子特性和引起的疾病特征上有一定差异。研究结果表明引起大口黑鲈溃疡性暴发病的病原是虹彩病毒，将该病暂命名为大口黑鲈病毒性溃疡病。