门冬胰岛素晶体的稳定性试验研究

目的本文旨在研究门冬胰岛素原料药结晶后的晶体稳定性,从而降低其在储运过程中质量变化的风险,为制剂提供稳定的原料药产品。方法门冬胰岛素晶体冻干成粉末后,按照中国药典生物制品有关稳定性试验标准对结晶粉进行影响因素试验、加速试验和长期试验。结果门冬胰岛素原料药晶体通过稳定性试验,检测的有关物质、高分子蛋白、含量、以及微生物限度的结果均符合中国药典标准。结论门冬胰岛素原料药晶体不仅符合中国药典标准,而且提高了门冬胰岛素的稳定性,为胰岛素晶体原料提供有力的数据支撑。

重组人胰岛素制备过程中转肽工艺的研究

目的:酵母表达体系制备重组人胰岛素的工艺中,转肽反应属于酶促半合成反应,过程复杂,成本高昂,通过实验研究提高反应效率,降低反应成本。方法:通过优化转肽反应中胰蛋白酶和双保护苏氨酸(Thr(But)OBut)的比例,寻找有利的反应条件,为进一步的条件确定奠定基础;从提高转肽反应物的反应效率出发,调整工艺顺序,将一步转肽反应调整为两步转肽反应;以胰蛋白酶和双保护苏氨酸两种反应物,进行综合成本分析比较;同时采用药典方法测定两种不同工艺制备的重组人胰岛素,进行生物活性的比较分析。结果:通过实验研究,一步转肽反应的收率最高可以达到74%,而两步转肽收率的收率最高可以达到90%;两步转肽反应相比一步转肽反应,酶量减少70%,双保护苏氨酸的使用量降低62.5%,同时提高了转肽反应中胰岛素原的反应浓度,达到12.5 mM,有着进一步开发的潜质;生物活性测定两种工艺生产的重组人胰岛素均符合中国药典的要求。结论:两步转肽反应对比一步转肽反应,提高了反应效率,产物的纯度较高,降低了反应的成本,有利于提高国产胰岛素的市场竞争力。

脂肪酸酰化修饰胰岛素的纯化

目的:脂肪酸酰化修饰的胰岛素类似物是常见的获得长效胰岛素的手段,但因其反应位点的偏差易产生多种传统纯化工艺较难以分离的杂质。本文探索以聚苯乙烯类有机聚合物填料为固定相纯化脂肪酸酰化修饰的胰岛素方法。方法:经过填料对比,有机溶剂浓度和pH选择后,再经过一系列正交试验优化,HPLC方法检验纯度和含量,质谱分析定性终产品,从而确定最佳条件。结果:经过对不同厂家不同型号的聚苯乙烯类有机聚合物填料的比较,填料选定采用纳微Uni Ps 30-300为最佳,其目的蛋白吸附量比为6.32 mg/ml,洗脱率为95.27%。在一系列的梯度实验中证实采用30-50%异丙醇浓度最佳。之后的pH对比得出,pH在4.0以下才能分离得到纯度在95%以上的产品。在以上一系列的单因素实验基础上,最后经过正交实验优化证实最佳的洗脱方案为采用A相为含25 mM硫酸铵的0.1 M磷酸盐缓冲液,pH 3.0;B相为异丙醇流动相,洗脱梯度为30-50%B的10 CV洗脱,流速60 cm/h。放大验证可以得到纯度大于97.5%,回收率70%以上的结果。结论:此方法具有分离效果好,成本低,易于放大的优点。