患M74综合症的波罗的海鲑鱼卵黄囊鱼苗组织病理学研究

本研究的目的是为了阐述在患有M74综合症期间的波罗的海鲑鱼的卵黄囊鱼苗组织病理学状况。我们希望能够估测患有不同类型的M74综合症的卵黄囊鱼苗的组织病理学图像的区别,也就是各家属组疾病的早期、中期和晚期的发展。在M74的临床前阶段,在卵黄囊鱼苗没有发现任何损坏。在临床阶段,很明显的发现脑部的坏死和骨骼肌肉和肝脏的糖原的损耗。患有早期疾病的卵黄囊鱼苗还会显示出早期颅内出血,肝细胞脂聚集,骨骼肌肉,以及肾近端小管(排泄物)的水肿恶化。在中期,脑部的坏死变得更加严重,而且,患有早期M74的卵黄囊鱼苗显示出肝细胞坏疽,有时骨骼肌肉的透明化。卵黄囊鱼苗的疾病的终期发展在很大程度上与(卵黄囊鱼苗的)早期发展相似,只是早期损坏程度较轻。晚期疾病的唯一主要的卵黄囊鱼苗组织病理学发现是脑部损伤和终期的囊血管扩张。

患M74的波罗的海鲑鱼(Salmo salar)抗氧化系统、解毒酶和维生素B_1量的研究

本文对患M74的波罗的海鲑鱼中抗氧化系统、解毒酶和维生素B_1的量进行了研究。在患M74的各家族组鱼卵中发现维生素B_1和类胡萝卜素降低。另外,还发现维生素B_1对卵黄囊鱼苗患M74的早期、中期或晚期,都产生一定影响。该研究揭示了氧化胁迫和M74之间相互作用的新资料。后来患M74的新孵化的卵黄囊鱼苗中可诱发肝过氧化氢酶(Hepatic catalase)的活性,然而发育期间的结果却相反。患M74的鱼苗则并不表现为肝过氧化氢酶活性随年龄增加而增强,而健康的卵黄囊鱼苗恰相反。肝谷胱甘肽过氧化酶(Hepatic glutothione peroxidase)和谷胱甘肽还原酶(Glutathione reductase)的活性随着病的发展有明显的增强,说明过氧化机制就是在发病机理之一。在健康的卵黄囊鱼苗中肝EROD的活性在孵化时低,并随年龄而增长。患M74期间,疾病的临床和后期阶段则显示了活性的减弱。

波罗的海鲑鱼(Salmo salar)、鳟鱼(Salmo trutta)和鳕鱼(Gadus morhua)体内的硫胺素(维生素B_1)浓度

近几十年间,波罗的海的一些鱼种一直受繁殖成功率不良的影响。波罗的海的海行鲑鱼种群受到M74综合症的影响,M74是一种与后代体硫胺素(维生素B_1)浓度低有关的早期死亡症状。为了研究具有类似M74症状和死亡率的波罗的海海行鳟鱼是否也遭受到低硫胺素浓度的影响,特对它们进行了硫胺素分析。此外还分析了波罗的海鳕鱼组织内的硫胺素合量。本研究证实,受M74的波罗的海鲑鱼遭受到低硫胺素水平的危害,而且M74发生的起始时间可能与有眼点卵(eyed egg)中的硫胺素浓度有关。此外,生产出带有M74的后代的母鱼其肌肉和卵巢中的硫胺素浓度明显低于生产出健康后代的母鱼的相应浓度,这表明,M74可能是母体留传的硫胺素缺乏症。波罗的海海行鳟鱼的初步资料显示,具备类似M74症状(昏睡、表皮变黑和100%死亡)的黄卵囊鱼苗其平均硫胺素浓度很低 (1994年为0.14nmol/g,1998年为0.34nmol/g),相比之下,健康后代的平均硫胺素浓度要高得多(1994年为4.4nmol/g,1998年为3.9nmol/g)。这表明,波罗的海鳟鱼的某些家族组可能受到与硫胺素缺乏有关的生殖失调的影响。在产卵的波罗的海鳕鱼中,肝和卵巢的硫胺素浓度有很大差异,肝的硫胺素浓度变化范围为0.56～4.7nmol/g,卵巢的硫胺素浓度变化范围为3.8～30nmol/g。波罗的海鳕鱼是否也遭受到硫胺素缺乏引起的死亡现在还不得而知。

与波罗的海鲑鱼(Salmo salar)M74综合症有关的微生物筛选

本研究的目标是确定波罗的海鲑鱼的M74鱼苗死亡综合症是否是和致病微生物导致的母体致病损害有关,还是和共生微生物变化引起体内平衡受扰产生的母体代谢损害有关。我们用广泛筛选和常规的方法分离和鉴定真菌、细菌和病毒。细菌用专门的16SrRNA顺序,微生物鉴定是根据两个复杂的基因组之间的差异分析用DNA减去的差别法,表达差别分析(RDA)。分离组织位点的选择是根据组织病理学数据。我们已知在其他动物中巴尔通氏体属(Bartonella)菌类是和心脏疾病有关,但还未发现和波罗的海鲑鱼的冠状动脉损害有关。在产卵洄游的长饥饿期,体内必需的物质如维生素是靠鲑鱼的肠内共生的微生物群落来提供的。从成年洄游的波罗的海鲑鱼的胃肠(GI)道系统,我们能分离出气单胞菌属(Aeromonas sobria)、腐败假单胞菌(Pseudomonas putrefa-ciens)一种假单胞菌(Pseudomonas),蓍水气单肥菌(A.hydrophi-la)和蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei),这些都能产生维生素B_2。P.putrefaciens菌株和Pseudomonas spp.能产生少量的维生素B_3。我们还发现对产卵的鲑鱼用甲醛进行化学药物处理似乎干扰共生的GI菌丛。在本研究完成时,我们应该能够推断出M74综合症是否由于人为干扰,例如化学药剂或其他环境污染物,危及母体健康和导致病原体细菌的激活或通过共生者干扰维生素的合成。

健康的以及产生患M74综合症子代的波罗的海鲑鱼(Salmo salar)肉、卵和血液中的有机卤素物质

我们用Dalalven河的海水洄游性雌鲑鱼的肌肉、卵和血液样本来分析中性和酚类有机卤素物质(OHS),以此来确认它们与野生波罗的海鲑鱼M74综合症的联系。在DDT及其同类化合物,多氯联苯(PCBs),多溴联苯醚(PBDEs),六氯苯(HCB),或甲氧溴化联苯醚(MeO—PBDEs)的浓度上观察到健康鲑鱼与产出患M74综合症后代的鲑鱼没有区别。大量的酚类化合物(大于100种)像多卤化(溴化和/或氯化)酚,多氯联苯醇(OH-PCBs)和OH-PB-DEs被鉴别或指示出来。在健康鲑鱼和产出患M74症后代鲑鱼的血液中都发现了高浓度的五氯酚(PCP)。与PBDEs同类物浓度相近的羟基化和甲氧基化PBDEs均有发现。在鲑鱼样品中鉴别出2-(2’,4’-二溴苯氧基)-4,6-二溴苯甲醚和相应的酚。产卵期间OHS在肉,卵和血浆类脂中的不同浓度比重取决于不同的OHS。没有观察到OHS浓度在健康鲑鱼和产出患M74症后代的鲑鱼之间有差异。因此,这些数据不支持M74疾病是由OHS引起这一理论。然而,该疾病与酚类OHS的关联尚需要更深入的考虑,因为有关这些物质的数据还比较有限。

波罗的海欧鳟(Salmo trutta)患M74综合症鲑鱼(Salmo salar)的生殖失调比较

瑞典哥特兰的Ar实验室在1994～1998年间的研究结果揭示了海欧鳟没有与波罗的海大西洋鲑鱼生殖失调类似的疾病。雌性卵黄囊鱼苗的死亡率从没超过11%,卵黄囊鱼苗的硫胺平均浓度(5.5±1.4nmol/g;n=20)大大超过受M74综合症影响的波罗的海鲑鱼鱼苗的阈值(0.31～0.34nmol/g;n=20)。对有眼基胚胎的虾青素分析表明其水平高于其后发育成患M74综合症的鱼苗。然而波罗的海鲑鱼胚胎低于Vanern湖和瑞典西海岸的Lagan河和Gotaalv河鲑鱼种群的水平。哥特兰鲑鱼所产胚胎中的类胡罗卜素总含量(mg类胡罗卜素/kg)随雌鱼体重的减小而明显降低。瑞典Ava河的波罗的海鲑鱼的卵黄囊鱼苗的死亡率在1992年出现高峰值(35±20%)。此外,波罗的海沿岸的3条河(Dalalven河,Indalsalven河,Umealven河)的海鳟鱼生殖失调的情况也已被报道。本文讨论了波罗的海鳟鱼和鲑鱼的生活史差别以及对波罗的海鳟鱼卵黄囊期鱼苗死亡率的较低影响。

生产过患M74综合症后代的海洋洄游波罗的海鲑鱼(Salmo salar)状况的改善

为了探讨治愈M74综合症的可能性,即使鲑鱼初孵鱼苗不发生M74综合症而死亡,对瑞典Dalalven河的海洋洄游波罗的海鲑鱼群体进行了两种不同的改善方法的研究。雌性鲑鱼状况的改善通过喂食和注射维生素B_1的方法获得。在第一项实验中,产卵的雌性鲑鱼喂食了一种商品化的适合孵卵鱼的饲料直至新的成熟期,这时挤出鱼卵。鱼卵与来自海洋洄游的雄性鲑鱼的精子结合而受精。跟综观察鱼卵和刚孵化的小鱼苗至鱼苗阶段。在第二项实验中,溯河雌性鲑鱼在成熟前一个月注射了维生素B_1并且将鱼卵取走。鱼卵和刚孵化的小鱼苗(alevins)以与第一项实验中相同的方式处理。喂食海洋洄游的鲑鱼很麻烦,只有13条雌性鲑鱼接受干食物。这些接受了干食物的雌性鲑鱼鱼卵中维生素B_1状况改善了十倍。对雌性鲑鱼注射维生素B_1也是很有效的,它们的鱼卵内的维生素B_1的浓度增长了13倍。在改善的雌性鲑鱼的后代中没有发现因M74综合症而导致的死亡。初孵鲑鱼苗的肝细胞酶CYP4501A的活性表现出因维生素B_1的浓度而改变,而且此活性在经过喂食改善的雌性鲑鱼产出的患M74综合症的初孵鲑鱼苗和健康的初孵鲑鱼苗孵化前被诱导,这表明一个良好的维生素B_1的状况比异型生物质的数量对此活性诱导所起的作用更为重要。

波罗的海鲑鱼(Salmo salar)胚胎内微量注射羟基硫胺素和多氯联苯的生理学和形态学作用:和M74综合症的比较

从1974年以来,海洋洄游性的波罗的海鲑的种群受到一种被称为M7综合症引起的早期生活阶段死亡的影响。M74综合症已经证明和硫胺素(Vitamin B_1)的缺乏有关,维生素B_1的缺乏导致和坏死的脑细胞有关的神经紊乱。用维生素B_1处理能抑制M74综合症的发展。在这项研究中,通过微量注射的方法,将维生素B_1的对抗剂羟基硫胺素和商品化的多氯联苯的混合物ClophenA50注射到海洋洄游性波罗海鲑鱼的睛点期胚胎卵的卵黄囊内。其目的是研究由实验引起的维生素B_1缺乏效应和通过7-乙氧基异吩噁唑酮-O-脱乙基酶(EROD)检测的方法研究它如何影响生物转化系统CYP1A。鲑鱼胚胎孵化以后,我们试图改变每个暴露组一半鲑鱼的维生素B_1缺乏状况,方法是将各组孵化出来的50%鲑鱼放入维生素B_1的溶液中,并且研究其对鲑鱼存活和EROD活性的影响。注射过羟基硫胺素的各组胚胎孵出的具卵黄囊鱼苗无论是否注射过Clophen A50,它们都明显表现出了协调性的丧失,不活泼,眼睛突出,变白的肝脏,接着全部死亡(100%)。基于这些现象和死亡的时间(孵化以后的124～193度日(d℃》,羟基硫胺素的作用可以和M74综合症对鲑鱼的作用相比拟,但是也观察到了不相似的地方。注射过羟基硫胺素的各组鲑鱼苗通过维生素B_1处理后延缓了死亡,而且死亡率下降到64.8%至91.8%。在注射Clophen A50的各组记录到其诱导EROD活性的剂量及时间依赖关系,而这种引导的剂量和时间依赖关系被注射过羟基硫胺素强烈地抑制。在第103和182d℃对注射过羟基硫胺素的鲑鱼进行组织病理学检查发现:肝糖水平下降,肝细胞退化而且坏死的脑细胞更普遍的出现,这些都是在受M74综合症影响的具卵黄囊鱼苗中发现的病理特征。注射Clophen A50的各组鱼无此组织病理学变化。

波罗的海鲑鱼的食物及其与M74综合症的关系

大部分波罗的海鲑鱼种群均患有M74综合症。M74综合症与海洋洄流鱼的饮食生态学有关。一项历时2年的研究(1995～1997)表明就波罗的海主体而言,在鲑鱼所吃的食物中黍腓占主导地位(以重量计占鲑鱼胃含量的45%～90%),其次是大西洋腓(占9%～39%)和三刺鱼(占0%～14%)。这一结果与本世纪60年代早期的报告相类似。无论是冬季1～4月黍鲱在鲑鱼的食物中总是占有较高比例,5～12月中则大西洋鲱和三刺鱼所占比例上升。比较波罗的海主体的东部和南部地区也发现一个趋势,即东部地区1～9月份鲑鱼的食物中黍腓只占较低的比例而大西洋腓则占较高的比例。然而就这两个十分保守的不同统计分析本身而言这一差别并不显著。(实验结果)同时还表明与60年代早期相比鲑鱼的冬季进食量增大了。回归分析表明M74发病率与描述波罗的海黍腓种群状况的几个参数密切相关,其中的两个是表示黍腓的重量参数。这意味着在分析M74发病的各种影响因素时需要将研究范围扩充至较低的营养级生物。