基于网络药理学及体外实验探讨黄芪甲苷治疗胃癌的机制

目的基于网络药理学方法及体外实验探讨黄芪甲苷治疗胃癌的分子机制。方法(1)通过SwissTarget、TargetNet、Super-PRED、pharmMapper数据库检索黄芪甲苷作用靶点;利用OMIM、GeneCards、TTD数据库筛选胃癌疾病相关靶点;取上述二者的交集靶点(共同靶点),即为黄芪甲苷治疗胃癌的潜在作用靶点。将交集靶点通过STRING平台建立蛋白互作(PPI)网络,并筛选出黄芪甲苷治疗胃癌的核心靶点。利用R语言包clusterProfiler软件进行潜在作用靶点的GO功能及KEGG通路富集分析,利用Cytoscape 3.8.2软件绘制“疾病-药物-通路-靶点”网络图。使用AutoDock 1.5.6软件进行核心靶点与黄芪甲苷的分子对接验证,并对关键靶点进行体外实验验证。(2)使用不同浓度(20、40、80、120、160、200μg·mL^(-1))黄芪甲苷分别干预MKN-45、HGC-27胃癌细胞24、48、72、96 h后,采用MTT法检测细胞增殖情况。采用80、120、160μg·mL^(-1)黄芪甲苷分别干预MKN-45、HGC-27胃癌细胞48 h后,采用Western Blot法检测细胞PIK3R1、PIK3CA、HSP90AA1、MAPK1、HRAS蛋白表达水平。结果(1)共得到87个黄芪甲苷治疗胃癌的潜在作用靶点;筛选出20个黄芪甲苷治疗胃癌的核心靶点;其中PIK3R1、PIK3CA、HSP90AA1、MAPK1、HRAS等核心靶点与黄芪甲苷的结合能<-5.0 kcal·mol-1,有较好的结合活性;潜在作用靶点主要涉及蛋白激酶信号通路、氧化、化学应激等生物学过程,以及PI3K/AKT信号通路、MAPK信号通路、Ras信号通路、Rap1信号通路等多条通路。(2)与对照组比较,黄芪甲苷在20~200μg·mL^(-1)浓度范围,分别干预24、48、72、96 h后,MKN-45、HGC-27细胞相对活力均明显降低(P<0.05,P<0.01),且呈现明显的时间、浓度依赖性。与对照组比较,120、160μg·mL^(-1)黄芪甲苷分别干预MKN-45、HGC-27胃癌细胞48 h后,PIK3R1、PIK3CA、HSP90AA1、MAPK1、HRAS蛋白表达水平均明显降低(P<0.05,P<0.01),且呈现明显的浓度依赖性。结论黄芪甲苷通过PIK3R1、PIK3CA、HSP90AA1、MAPK1、HRAS等多靶点,调控PI3K/AKT信号通路、MAPK信号通路等多通路,发挥治疗胃癌的作用。

脂多糖对胃癌细胞mir-146a-5p、mir-335-5p及TLR_(1～10)受体表达的影响

目的 研究胃癌细胞在受到脂多糖干预后,TLR_（1~10）受体及上游调控分子mir-335-5p和mir-146a-5p的表达规律。方法 PCR Array筛选结合实时荧光定量PCR检测验证TLR_（1~10）mRNA在不同分化程度胃癌细胞中的表达;实时荧光定量PCR检测不同浓度的脂多糖（终浓度分别为0.1、1.0、10.0、100.0μg/mL）干预胃癌SGC-7901、BGC-823细胞和GES-1细胞12、24、48h后,mir-335-5p、mir-146a-5p及TLR_（1~10）的表达。结果 实时荧光定量PCR检测验证表明,除TLR_1、TLR_3、TLR_5外,其余的Toll样受体mRNA在不同分化程度胃癌细胞中的表达相对于正常胃黏膜上皮GES-1细胞出现明显上调;不同浓度的脂多糖干预胃癌SGC-7901、BGC-823细胞和GES-1细胞12、24、48h后,相对于未干预胃癌细胞,mi-335-5p和mir-146a-5p的表达明显下调;在SGC-7901细胞中,除TLR_3、TLR_4外,其他TLR受体在不同浓度脂多糖干预后,均有不同程度的上调表达;在BGC-823细胞中,TLR_1、TLR_4、TLR_6受体仅在高浓度脂多糖干预时,上调表达,其他TLR受体在不同浓度脂多糖干预后,均有不同程度的上调表达;在GES-1细胞,所有TLR_（1~10）在不同浓度脂多糖干预后均有明显上调表达。结论 脂多糖干预胃癌细胞,可诱导mir-335-5p、mir-146a-5p下调表达和Toll样受体mRNA上调表达,Toll样受体mRNA上调表达可能与mir-335-5p、mir-146a-5p下调有关。

当归贝母苦参丸加味方对荷瘤小鼠H22肝癌肿瘤组织MMP13和bFGF表达的影响

目的研究当归贝母苦参丸加味方对H22荷瘤小鼠瘤组织基质金属蛋白酶13(MMP13)和成纤维细胞生长因子2(bFGF)表达的影响。方法建立H22荷瘤小鼠模型进行体内抗肿瘤试验,将60只荷瘤小鼠随机分为模型组,顺铂阳性对照组,当归贝母苦参丸加味方高、低剂量组,当归贝母苦参丸加味方高、低剂量联合顺铂组,连续灌胃给药14d,观察肿瘤生长情况以及小鼠一般情况,肿瘤大体标本及HE染色后组织形态观察;RT-qPCR和免疫组织化学技术分别检测肿瘤组织中MMP13和bFGF的表达。结果大体观察剥离的肿瘤瘤体发现,模型组与中药低剂量组瘤体较大,瘤体内有溃烂,包膜基本完整;各治疗组瘤体较模型组相比较小,但包膜不完整,有不同程度溃烂,剥离易出血,当归贝母苦参丸加味方高、低剂量联合顺铂组瘤体小,包膜完整,肿瘤溃烂较少;HE染色病理形态观察发现,各治疗组结缔组织明显,细胞稀疏程度增加,坏死癌细胞数目增加。RT-qPCR检测显示,与模型组相比,各用药组中MMP13和bFGF mRNA的表达量均降低,差异有统计学意义(P<0.05);免疫组化检测显示,MMP13和bFGF在当归贝母苦参丸加味方高、低剂量联合顺铂组中蛋白着色变浅,呈弱阳性表达,当归贝母苦参丸加味方高、低剂量联合顺铂组较单独用药蛋白表达量低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论当归贝母苦参丸加味方可以在mRNA和蛋白水平下调荷瘤小鼠肿瘤组织中MMP13和bFGF的表达,进而抑制肿瘤侵袭和血管生成,发挥抑瘤减毒增效目的。