野生罂粟BBE基因克隆及RNAi载体构建

以野生罂粟(Papaver somniferum)试管苗幼叶为材料,用Trizol试剂盆提取总RNA,通过RT-PCR法获得BBE基因的cDNA片段,序列分析表明,所获得的cDNA序列全长1 608 bp,具有完整的开放阅读框(ORF),编码536个氨基酸,经blast检索该片段与GenBank中的小檗碱桥酶基因BBE(AF025430)同源性为94.84%.以中间载体pHANNIBAL和植物表达载体pART27为基础,构建了CaMV-35S启动子驱动的含小檗碱桥酶基因片段反向重复序列的RNAi双元表达载体pARB,为培育低吗啡,高蒂巴因的罂粟新品系奠定了基础.

野生罂粟RNAi表达载体的构建及遗传转化

通过PCR方法从质粒pGEM-bc中克隆野生罂粟BBE-COR融合基因片段约760 bp,以pHANNIBAL和植物表达载体pCAMB IA3300为基础,将克隆到的BBE-COR融合基因正向和反向片段分别插入pdk内含子的两边,经酶切、PCR鉴定及序列分析表明,特异性RNA i表达载体p3300-pHR构建成功。采用直接转化法,将重组子导入根癌农杆菌AGL1中。以野生罂粟茎尖生长点为转化受体,用农杆菌介导法将目的基因转入野生罂粟中。经卡那霉素和除草剂筛选后,共获得53株转基因植株,PCR检测后,其中14株表现阳性,可初步确定目的基因已经整合到野生罂粟基因组中。

野生罂粟COR、BBE基因片段融合及其RNAi载体构建

可待因酮还原酶(COR)与小檗碱桥酶(BBE)是吗啡合成代谢途径的关键酶,其活性大小直接影响着吗啡合成途径中生物碱的代谢合成。采用RT-PCR从罂粟幼叶克隆出COR和BBE基因全序列,同源性比较结果显示,它们与GenBank上已报道的COR和BBE基因高度同源。利用blast及分子生物学软件DNAStar对COR和BBE基因的cDNA序列同源性进行分析比较,分别从各基因中筛选和克隆了一段同源性极低、约400～500bp的片段;并应用重叠PCR法将其拼接成744bp的融合基因BC,以中间载体pHANNIBAL和植物表达载体pART27为基础,构建了以CaMV35S启动子驱动的含有"正向BC融合片段-pdk内含子-反向BC融合片段"的ihRNAi植物表达载体,通过转化野生罂粟,初步研究了以COR和BBE基因为靶标的RNAi对内源吗啡合成的抑制效果,为进一步培育低吗啡高蒂巴因的罂粟种质提供了依据。