绿色荧光蛋白和胰岛素基因共表达重组腺病毒载体的构建及感染人脐带间充质干细胞的实验研究

目的构建同时表达绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因和人胰岛素(insulin,INS)基因的重组腺病毒载体pAdxsi-EGFP-INS,并感染人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs),观察其表达及诱导hUCMSCs成脂分化的作用。方法用EcoRI/XhoI将胰岛素基因从原始质粒上切下,定向插入至pShuttle-CMV-EGFP穿梭质粒,将验证正确的pShuttle-CMV-EGFP-INS中的EGFP-INS片段转移至pAdxsi载体上,构建pAdxsi-EGFP-INS重组腺病毒载体,用PacI限制性内切酶线性化后转染人胚肾细胞系HEK293细胞,扩增纯化重组腺病毒,测定病毒滴度。原代培养hUCMSCs,分别用pAdxsi-EGFP-INS(感染组)及pAdxsi-EGFP(对照组)腺病毒感染hUCMSCs,观察荧光蛋白的表达情况,成脂诱导剂诱导分化,油红O染色观察胰岛素对hUCMSCs成脂的诱导作用。结果成功构建pAdxsi-EGFP-INS重组腺病毒载体,包装、纯化后获得滴度达4×1011pfu/ml的重组腺病毒。分离获得hUCMSCs并传代、纯化,pAdxsi-EGFP-INS感染hUCMSCs后,EGFP-INS在胞浆及胞核表达;成脂诱导培养18 d后,感染组细胞呈现出含有大量小脂滴的脂肪样细胞,而对照组细胞含有少量较大的脂滴,感染组含脂滴的脂肪样细胞数量多于对照组。结论获得的pAdxsi-EGFP-INS重组腺病毒可高效感染hUCMSCs,为进一步研究胰岛素在干细胞成脂诱导分化中的作用,追踪其在体内、体外表达情况提供了新工具。

人脐带间充质干细胞联合褪黑素治疗化疗致早发性卵巢功能不全的作用及机制

背景:目前研究证明,人脐带间充质干细胞和褪黑素均可改善卵巢功能,但人脐带间充质干细胞联合褪黑素对化疗所致早发性卵巢功能不全的保护作用及机制尚未有研究报道。目的:探讨人脐带间充质干细胞联合褪黑素对化疗所致早发性卵巢功能不全的保护作用及机制。方法:将动情周期正常的40只Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、人脐带间充质干细胞组、褪黑素组和人脐带间充质干细胞+褪黑素组,每组8只。除对照组外,其他组腹腔注射顺铂溶液构建早发性卵巢功能不全大鼠模型,人脐带间充质干细胞组和人脐带间充质干细胞+褪黑素组于造模后第1,6,11天分别尾静脉注射1×10^(6)个人脐带间充质干细胞,褪黑素组和人脐带间充质干细胞+褪黑素组每日腹腔注射10 mg/kg褪黑素,治疗期间监测大鼠体质量和动情周期变化。治疗14 d后,ELISA法检测血清雌二醇、卵泡刺激素、促黄体生成素、抗缪勒管激素水平,计算卵巢指数,苏木精-伊红染色观察卵巢组织学形态,透射电镜观察卵巢颗粒细胞超微结构,Western blot检测PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白和LC3、P62等自噬蛋白在卵巢组织中的表达。结果与结论:(1)与对照组相比,模型组大鼠体质量逐渐减轻、动情周期紊乱,卵巢指数显著下降(P<0.01);雌二醇、抗缪勒管激素水平降低(P<0.01),卵泡刺激素、促黄体生成素水平升高(P<0.01);卵巢组织学形态和卵巢颗粒细胞超微结构严重破坏;p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR和P62蛋白表达显著降低(P<0.01),LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达显著升高(P<0.001)。(2)与模型组相比,各治疗组大鼠体质量逐渐恢复,部分大鼠动情周期恢复正常,卵巢指数显著升高(P<0.01);雌二醇、抗缪勒管激素水平升高(P<0.05),卵泡刺激素、促黄体生成素水平降低(P<0.05);卵巢组织学形态和卵巢颗粒细胞超微结构显著改善;p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR和P62蛋白表达显著升高(P<0.001),LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达显著降低(P<0.01)。其中人脐带间充质干细胞+褪黑素组上述指标改善更为显著。结果表明,人脐带间充质干细胞联合褪黑素可能通过上调PI3K/AKT/mTOR信号通路,抑制卵巢颗粒细胞自噬来治疗早发性卵巢功能不全。

肝细胞生长因子基因重组腺病毒修饰间充质干细胞修复急性放射性损伤大鼠的创面

背景:基因药物与干细胞联合应用促进难治性大面积创面修复。目的:观察携带肝细胞生长因子基因的重组腺病毒(adenovirus hepatocyte growth factor,Ad-HGF)修饰的间充质干细胞对大鼠皮肤放射性损伤创面促愈合的作用。方法:体外分离、培养雄性Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,转染Ad-HGF后备用。40只雌性Wistar大鼠用X射线局部照射制备急性放射性皮肤损伤模型。并将模型大鼠随机分为单纯间充质干细胞治疗组、单纯Ad-HGF治疗组、Ad-HGF修饰的间充质干细胞治疗组、溶剂对照组4组,制备模型即刻各组将相应细胞悬液、病毒悬液及溶剂行创面边缘多点注射。结果与结论:苏木精-伊红染色结果显示,伤后21d Ad-HGF修饰的间充质干细胞治疗组再生表皮明显薄于溶剂对照组,并可见丰富的新生小血管,且表皮较单纯间充质干细胞治疗组和单纯Ad-HGF治疗组更平整,新生小血管更丰富;免疫组织化学结果表明,Ad-HGF修饰的间充质干细胞治疗组创面中肝细胞生长因子表达均强于其他组;羟脯氨酸含量Ad-HGF修饰的间充质干细胞治疗组在7d后显著低于其他组(P<0.05);原位杂交结果显示,Ad-HGF修饰的间充质干细胞治疗组修复的皮肤组织中性别决定基因sry表达强于单纯间充质干细胞治疗组。结果提示,Ad-HGF修饰的间充质干细胞对皮肤放射性损伤创面有显著的促愈合修复作用,且优于二者单独应用。

肝细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞对糖尿病大鼠下肢缺血肌肉损害的保护作用

目的观察携带人肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)基因的重组腺病毒(Ad-HGF)修饰后的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)对糖尿病大鼠下肢缺血肌肉组织的影响。方法体外分离、培养大鼠骨髓MSCs,以最佳感染强度转染Ad-HGF后备用。健康Wistar大鼠,给予高脂、高糖饲料饲养加小剂量STZ腹腔注射建立实验性2型糖尿病大鼠模型,经1%戊巴比妥钠麻醉后无菌手术暴露左侧后肢股动脉起始端及其分支并完全结扎,造成急性后肢缺血。并将模型大鼠随机分为Ad-HGF修饰的骨髓MSCs治疗组(A组),溶剂对照组(B组),每组8只。制备缺血模型后A组将Ad-HGF修饰的骨髓MSC、B组将PBS于术后10 min内行手术部位多点肌内注射。2组于手术注射后6周,取结扎后肢内与外侧肌肉组织,常规组织病理切片染色,在光学显微镜下观察其组织病理学变化。结果 B组大鼠因股动脉被结扎而使血运严重受到干扰的患肢肌肉组织都发生了显著的病理改变,肌纤维变性、断裂、肌束内水肿、脂肪性变,肌束间动脉管壁变厚,管腔变小甚至消失,少见新生的小血管;A组上述病变不明显。结论 Ad-HGF修饰的骨髓MSCs的局部应用可减轻或改善糖尿病大鼠下肢缺血后肌肉组织损伤,提示AdHGF修饰的骨髓MSCs对糖尿病大鼠下肢缺血性肌肉损伤具有明显的保护作用。

携带人胰岛素基因腺病毒载体转染人脐带间充质干细胞及其成脂分化

背景:胰岛素是成脂诱导剂的重要组成成分。然而胰岛素存在半衰期,会随着体内代谢不断灭活及降解,植入体内的细胞或材料无法像体外那样以更换培养液来达到目的。实验拟通过转染胰岛素基因,使转染后的干细胞稳定分泌胰岛素,促进其成脂分化。目的:探讨携带人胰岛素基因腺病毒载体转染人脐带间充质干细胞后对其成脂分化能力的影响。方法:取第3代人脐带间充质干细胞,以感染复数为20转染腺病毒载体。实验分为4组:对照组为第4代人脐带间充质干细胞;实验组1为腺病毒转染的第4代人脐带间充质干细胞;实验组2为第4代人脐带间充质干细胞+成脂诱导液;实验组3为腺病毒转染的第4代人脐带间充质干细胞+成脂诱导液。结果与结论:转染48h后实验组1和实验组3的人脐带间充质干细胞在荧光显微镜下显现弱荧光,72h后荧光较强。经脂肪诱导培养液培养14d后,实验组1,2,3油红O染色后显微镜下呈红色,对照组未见脂滴形成,实验组1可见一些细小脂滴形成;实验组3与实验组2相比,脂滴大且多,定量分析显示,实验组3油红O染色阳性的面积和吸光度大于实验组2(P<0.05)。由此说明携带人胰岛素基因腺病毒载体转染人脐带间充质干细胞后可促进其成脂能力。

HGF基因修饰的间充质干细胞对犬后肢缺血后股神经的保护作用

目的观察携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒(Ad-HGF)修饰的骨髓间充质干细胞(MSC)对犬后肢缺血后神经组织病理学的影响。方法 18只犬随机分为Ad-HGF-MSC处理组、模型对照组和正常对照组,每组6只。将Ad-HGFMSC处理组和模型对照组犬麻醉后,全结扎左后肢股动脉制作犬左后肢缺血模型,体外分离、培养犬骨髓MSC,转染Ad-HGF,并将含Ad-HGF-MSC的细胞悬液对Ad-HGF-MSC处理组犬病肢行多点肌肉注射,模型对照组犬注射等量的PBS缓冲液,正常对照组不进行任何处理。90 d后,取组织标本,常规组织病理切片染色,光学显微镜下观察。结果 12只犬均建模成功。模型对照组犬病侧股神经至肌束间的细小神经均发生显著退行性变,累及轴突、髓鞘和施旺细胞核。而Ad-HGF-MSC处理组犬的各级神经病变不明显,部分甚至与正常对照组无差别。结论 Ad-HGF-MSC局部注射可减轻或阻遏犬后肢缺血后股神经组织损伤,具有一定的神经组织保护作用。

Sry基因监测腺病毒介导肝细胞生长因子修饰的骨髓间充质干细胞移植在大鼠烫伤创面愈合中的作用

目的制备地高辛标记的Sry探针，监测局部异体移植携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒（Ad—HGF）修饰的骨髓间充质干细胞（BMSCs）在烫伤创面愈合中的作用。方法用雄性大鼠肝组织通过聚合酶链反应法克隆Sry基因，并将其构建至TEasyVector上，用地高辛标记法制备Sry基因原位杂交探针。密度梯度离心法体外分离培养雄性Wistar大鼠BMSCs，并转染Ad-HGF。复制16只背部深Ⅱ度烫伤雌性大鼠模型，于造模成功后，将Ad-HGF修饰的BMSCs一次性多点注射于创面真皮下。21d后，处死大鼠，取愈合创面新生组织和正常组织制作石蜡切片，原位杂交法检测组织切片中Sty基因的表达。结果①从8只雄性大鼠中成功克隆出Sry基因；②制备出地高辛标记的Sry探针；③16只雌性大鼠深Ⅱ度烧伤模型复制成功，用Ad-HGF修饰的BMSCs治疗后，原位杂交法证实全部雌鼠创面新生组织中有Sry表达，而正常组织中未检测到。结论外源移植的BMSCs参与了大鼠烫伤创面的修复，Sry基因可作为细胞追踪标记，为细胞治疗追踪技术及利用BMSCs治疗创伤的研究提供依据。

携带肝细胞生长因子基因的减毒沙门菌促血管形成的实验研究

目的探讨携带肝细胞生长因子(HGF)基因的减毒沙门菌体外促血管形成的效应。方法构建携带HGF基因真核表达载体的减毒沙门菌菌株(TPH),体外转染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)后观察目的基因表达及其增殖活性;评价TPH的细胞表达上清对鸡胚绒膜尿囊膜血管生成效应的刺激效应。结果构建的TPH菌株在体外可有效转染HUVEC并表达有活性的HGF蛋白,6×10~5个HUVEC细胞可表达160~190 ng的HGF蛋白,和对照组相比,TPH转染组细胞表达上清可明显促进HUVEC增殖,而且具有剂量-效应关系;TPH转染组细胞表达上清也刺激鸡胚绒膜尿囊膜小血管生成,其血管数量(133.0±11.5)/cm^2明显大于转染TP的HUVEC细胞上清组(83.3±5.5)/cm^2和对照组(62.7±7.1)/cm^2(P<0.05)。结论携带HGF基因的减毒沙门菌可有效转染HUVEC并促进细胞增殖,刺激小血管新生,可能在组织创面愈合中起重要作用,在胃溃疡治疗中有潜在的应用价值。

减毒沙门菌介导肝细胞生长因子基因治疗大鼠胃溃疡的实验研究

目的探讨减毒沙门菌介导的肝细胞生长因子（HGF）基因治疗对大鼠实验性胃溃疡的效果。方法构建HGF真核表达载体pcKH，将pcKH和对照质粒pcK转入Ty21a减毒沙门菌中，构建携带pcKH和pcK的阳性工程菌TPH和TP。将40只Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、TP治疗组和TPH治疗组，每组10只；TP治疗组、TPH治疗组和模型对照组采用冰乙酸诱导方法制备大鼠乙酸性胃溃疡模型，造模后第5天分别给予5ml含1×10^9cfuTP和TPH的10％NaHCO3及同体积10％NaHCO3溶液灌胃，1次／d，共3次。治疗结束后第21天肉眼及镜下观察胃溃疡愈合情况，计算溃疡面积、测量胃黏膜上皮的爬行长度；检测HGF在胃溃疡黏膜组织中的表达水平。结果成功构建携带HGF基凶真核表达质粒的减毒沙门菌。治疗后21d，病理结果表明TPH治疗组大鼠胃黏膜上皮增生明显，增生黏膜腺体明显扩张，溃疡已由肉芽组织充填，且可见丰富的毛细血管；模型对照组和TP治疗组溃疡愈合不明显。TPH治疗组溃疡面积明显小于模型对照组和TP治疗组[（11±3）mm^2比（56±6）、（43±4）mm^2]，差异有统计学意义（P〈0．05）。TPH治疗组黏膜上皮增生爬行长度明显大于模型对照组和TP治疗组[（879±8）mm比（821±10）、（817±14）mm]，差异有统计学意义（P〈0．05），TPH治疗组胃溃疡黏膜组织中HGF表达水平明显高于模型对照组和TP治疗组[（0．88±0．18）μg／g蛋白比（0．51±0．08）、（0．34±0．15）μg／g蛋白]，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论携带HGF基因的减毒沙门菌可促进大鼠胃溃疡黏膜上皮增生，加快溃疡愈合。

间充质干细胞及外泌体对高原脑水肿的潜在作用机制研究进展

近年来,短期、长期居住在高海拔地区的人数不断增加,超过8160万人生活在海拔≥2500米的地区,而中国常居高原者超过1000万,每年进入高原的人口超过2000万。独特的高原气候引发了一系列高原相关性疾病,其中高原脑水肿(HACE)是最严重的疾病之一,如果不及时进行适当治疗,患者可能会在24 h内因脑疝死亡。然而,HACE发展的确切机制尚不完全清楚,使得HACE的防和治具有挑战性。间充质干细胞(MSC)及间充质干细胞外泌体(MSC-Exos)具有修复受损组织和细胞、抗氧化应激、抑制炎症反应、调节自噬等作用,有可能成为防治HACE的新型药物。本文结合国内外相关文献阐述高原脑水肿发病机制及MSC、MSC-Exos在其中可能发挥的作用,为MSC、MSC-Exos防治HACE提供理论依据。

槲皮素对微重力引起骨髓间充质干细胞衰老的影响研究

目的 研究槲皮素对微重力作用下建立的骨髓间充质干细胞衰老模型的影响。方法 用3D回转仪构造骨髓间充质干细胞衰老模型,给予细胞槲皮素后进行相关蛋白检测、氧化指标检测对药物抗衰老作用进行评估研究。结果 与对照组相比微重力组细胞的衰老相关蛋白p21、p16、p53、RB的表达显著性上升、细胞周期蛋白Cyclin D1、核纤层蛋白lamin B1表达显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。并且微重力组细胞线粒体膜电位明显下降(P<0.05),细胞ROS蓄积量明显上升(P<0.05),SOD含量明显下降(P<0.05),MDA含量明显上升(P<0.05)。相较于微重力组细胞,槲皮素组细胞的衰老相关蛋白p21、p16、p53、RB的表达显著性下降、细胞周期蛋白cyclin D1、核纤层蛋白lamin B1表达显著上升,差异具有统计学意义(P<0.05)。并且槲皮素组细胞线粒体膜电位明显上升(P<0.05),细胞ROS蓄积量明显下降(P<0.05),SOD含量明显上升(P<0.05),MDA含量明显下降(P<0.05)。结论 槲皮素可抗氧化、保护线粒体功能、保护细胞周期正常进行,从而延缓微重力导致的骨髓间充质干细胞衰老。

骨髓间充质干细胞移植修复高原大鼠股骨缺损

背景:对于高原地区受到环境负面影响的组织创伤,例如高原骨缺损,干细胞的特点可以提供一个良好的加速创伤修复的方法。目的:研究骨髓间充质干细胞治疗大鼠高原股骨缺损的创伤恢复效果。方法:分离提取雄性Wistar大鼠原代骨髓间充质干细胞,取第3代细胞进行细胞表型鉴定。雌性Wistar大鼠80只,制备实验性股骨圆形缺损后随机均分为平原对照组、平原骨髓间充质干细胞移植组、高原对照组、高原骨髓间充质干细胞移植组(n=20)。治疗后第30天拍X射线片观察股骨缺损区的修复情况,并于第10,20,30天分别采集股骨缺损区组织,检测其中碱性磷酸酶的含量。结果与结论:高原骨髓间充质干细胞移植组大鼠股骨缺损区愈合速度较高原对照组快,且碱性磷酸酶的含量较高原对照组高(P<0.05);平原骨髓间充质干细胞移植组的缺损区愈合速度也比平原对照组快,且碱性磷酸酶的含量也较平原对照组高(P<0.05)。平原骨髓间充质干细胞移植组的缺损区愈合速度较高原骨髓间充质干细胞移植组快,且碱性磷酸酶的含量较高原骨髓间充质干细胞移植组高(P<0.05)。说明骨髓间充质干细胞的局部移植可提高高原股骨缺损区局部的碱性磷酸酶含量,加速缺损区的创伤修复速度,但高原股骨缺损区的愈合修复较平原组慢。

骨髓间充质干细胞在大鼠脊髓损伤治疗中的应用

目的探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对大鼠脊髓损伤(SCI)修复的作用。方法全骨髓贴壁法分离培养骨髓MSCs,采用自由落体撞击法制作大鼠SCI模型,建模大鼠存活24只,分为移植组和对照组,每组12只,移植组在损伤部位移植培养的骨髓MSCs,对照组给予等量生理盐水。根据联合行为学评分评价两组大鼠运动能力恢复情况,观察脊髓组织病理学变化、神经细胞损伤与修复及SRY基因的表达情况。结果移植组治疗后不同时间联合行为学评分均高于对照组(P<0.05)。对照组脊髓组织中出现较多空腔,神经纤维及细胞坏死;移植组脊髓组织空泡减少,增生组织增多,神经纤维及细胞增多,且有SRY基因的表达。结论骨髓MSCs移植可促进大鼠SCI修复。

CD4^+CD25^+调节性T细胞在多脏器功能障碍综合征中的变化及药物干预

目的探讨CD4^+CD25^+调节性T细胞(Treg)在多器官功能障碍综合征(MODS)大鼠外周血中的变化及乌司他丁和血必净的干预效果。方法以内毒素(LPS)建立MODS模型,并以乌司他丁和血必净注射液干预。应用流式细胞仪检测Treg水平变化。结果模型组、乌司他丁组和血必净组CD4^+CD25^+Treg的百分比明显高于对照组(P<0.05或P<0.01);乌司他丁组和血必净组的水平又明显高于模型组(P<0.05或P<0.01),但二组相比无统计学差异(P>0.05)。结论 CD4^+CD25^+Treg在大鼠MODS中的百分比升高,并参与了MODS的病情调节;乌司他丁和血必净能调升CD4^+CD25^+Treg的相对含量。

组织芯片观察CD44^＋/CD166^＋结直肠癌干细胞的形态及分布

背景:越来越多的研究将CD44作为结直肠癌干细胞的一个特异性的标志物。目的:观察结直肠癌干细胞CD44+/CD166+在原发性结直肠癌组织中的数量、位置及分布方式。方法:取61份结直肠癌、10份正常肠黏膜组织及18份伴不典型增生的结直肠腺瘤标本制成42点的共3块组织芯片。结果与结论:免疫组织化学双染结果显示,正常肠黏膜中未见CD44+/CD166+细胞,在伴不典型增生腺瘤中可见极少量CD44+/CD166+细胞,结直肠癌中可见到少量CD44+/CD166+双阳性细胞。双阳性细胞主要分布在结直肠癌腺管基底侧,呈灶状或散在分布;细胞呈立方形,胞浆稀少,胞核规则,呈卵圆形或高柱状,随着结直肠癌分化程度的降低,数量增多,且其数量在浸润较深的癌巢中较多。提示结直肠癌干细胞的数量、位置、分布方式及其形态有助于结直肠癌的诊断及判断预后。

结直肠腺癌组织中CD44^+/Oct4^+癌干细胞的形态及分布

背景:越来越多的证据显示CD44可作为结直肠腺癌干细胞的一个特异性的标志物,近年发现胚胎干细胞转录因子Oct4在结直肠腺癌中有表达。目的:观察CD44+/Oct4+细胞在原发性结直肠腺癌组织中的数量、位置及分布方式。方法:取108例结直肠腺癌、18例癌旁正常肠黏膜组织及18例伴不典型增生的结直肠腺瘤标本制成48点共3块组织芯片,应用免疫组织化学双重染色和苏木精-伊红染色,定位CD44+/Oct4+肿瘤细胞,观察计数并在苏木精-伊红切片的对应位置上观察其形态特征。结果与结论:免疫组织化学双重染色结果显示,癌旁正常肠黏膜中未见CD44+/Oct4+细胞,在伴不典型增生的腺瘤中可见极少量CD44+/Oct4+细胞,结直肠腺癌中可见到少量CD44+/Oct4+细胞。双阳性细胞主要分布在腺管样结构基底膜侧或共壁腺体的共壁侧,呈小灶状或散在点状分布;细胞呈卵圆形或立方状,胞浆稀少,胞核规则,均质深染,呈卵圆形或高柱状。其数量与结直肠癌分化程度呈负相关(r=-0.579,P<0.01),与肿瘤浸润深度有一定关联(r=0.236,P<0.05)。结果提示CD44+/Oct4+细胞可能是结直肠腺癌干细胞。

人脐带间充质干细胞体外培养、鉴定及其诱导分化的研究

目的通过体外分离、培养及鉴定人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs),探讨其多向分化潜能。方法取正常足月新生儿脐带,采用组织贴壁培养法分离原代hUCMSCs,观察细胞生长形态。采用流式细胞仪技术检测hUCMSCs细胞表型及细胞周期。通过成神经细胞诱导和成脂肪细胞诱导,鉴定hUCMSCs的多向诱导分化能力。结果成功分离和培养hUCMSCs原代细胞,经流式细胞仪鉴定高表达间质细胞标志CD44和CD105,阳性率为96.73%和96.10%,整合素受体CD29阳性率为99.53%;低表达造血系标志CD34和CD45阳性率为0.80%和1.91%,人白细胞抗原HLA-DR阳性率为1.41%。细胞周期检测hUCMSCs主要处于G0/G1期。hUCMSCs成神经细胞诱导,出现神经元样细胞;免疫组化检测神经巢蛋白(Nestin)呈阳性表达。hUCMSCs成脂肪细胞诱导,出现空泡样脂肪滴,油红O染色可见脂质沉积。结论 hUCMSCs具有多向分化潜能,可跨胚层诱导分化为多种组织类型的细胞。

丹酚酸B对人脐带间充质干细胞向胆碱能神经元分化的影响

目的:评估不同剂量丹酚酸B联合脑源性神经营养因子(BDNF)对人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)向胆碱能神经元分化的影响。方法:流式细胞技术鉴定培养的hUCMSCs细胞表型;MTT法评估丹酚酸B浓度对hUCMSCs细胞增殖生存率的影响;观察3种不同剂量丹酚酸B联合BDNF诱导hUCMSCs分化后的细胞形态学变化;ELASA法测定培养上清液中乙酰胆碱(Ach)浓度,免疫组化法测定细胞神经巢蛋白(Nsetin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胆碱乙烯转移酶(ChAT)表达水平。结果:hUCMSCs细胞表型具有干细胞的表型特征,丹酚酸B随着作用浓度的增大对hUCMSCs的增殖具有抑制作用。丹酚酸B联合BDNF诱导分化后的hUCMSCs可见神经元样分化及轴突形成的网状结构;上清液Ach浓度和细胞Nestin、NSE及ChAT表达率,在中、高剂量联合组中的表达均高于低剂量联合组和BDNF组(P<0.05),而中、高剂量联合组之间差异不显著。结论:丹酚酸B联合BDNF能提高hUCMSCs向胆碱能神经元分化效率,丹酚酸B的最宜诱导分化浓度为50 mg/L。

结直肠癌CD44^+/ki-67^-癌干细胞特征及其与临床病理关系

目的:观察CD44+/ki-67-结直肠癌干细胞的特征及其与临床病理特征的关系.方法:应用免疫组织化学染色、免疫组织化学双重染色和苏木精-伊红(HE)染色,检测10例正常肠黏膜,15例腺瘤,59例结直肠癌标本和人结肠癌细胞株SW620中CD44和ki-67的表达,定位CD44+/ki-67-肿瘤细胞,观察、计数并与对应的HE染色切片进行形态学比较,讨论CD44+/ki-67-癌干细胞与其临床病理特征的关系.结果:CD44+/ki-67-肿瘤细胞的数量占肿瘤细胞0.1%-25.0%,平均5.82%,这种细胞主要分布在腺体基底膜侧或者在共壁腺体的共壁侧,呈散在分布,核的形态较一致,呈圆形或卵圆形,染色质较深,胞浆较少,与正常肠黏膜隐窝底部干细胞形态较一致,与肿瘤浸润深度(χ2=1.851,P<0.05)和是否有淋巴结转移相关(χ2=-4.113,P<0.01).结论:CD44+/ki-67-可以作为肿瘤干细胞的标志,这为肿瘤干细胞的分离、靶向治疗和个体化治疗提供了可靠的分子生物学指标,也是预测肿瘤转移和判断患者预后的可靠指标.

结直肠癌组织中CD44^+/SOX2^+肿瘤干细胞的分布及形态特征

背景:CD44是常用的结直肠癌肿瘤干细胞标志物,近年来发现转录因子SOX2是潜在的结直肠癌肿瘤干细胞标志物。目的:观察CD44^+/SOX2^+细胞在结直肠癌组织中的数量、分布及形态特征,探讨CD44^+/SOX2^+是否可作为结直肠癌肿瘤干细胞标志物。方法:运用免疫组织化学双重染色方法观察10例正常肠黏膜、20例结直肠腺瘤及88例癌组织标本中CD44^+/SOX2^+细胞的数量、分布规律;苏木精-伊红染色观察结直肠癌组织中CD44^+/SOX2^+细胞的形态特征。结果与结论:(1)正常肠黏膜中未见到CD44^+/SOX2^+细胞,结直肠腺瘤组织中可见极少量CD44^+/SOX2^+细胞,结直肠癌中可见少量CD44^+/SOX2^+细胞;(2)CD44^+/SOX2^+细胞在高、中分化腺癌中呈小灶性或点状散在分布于隐窝基底部或共壁腺管侧,在低分化腺癌中呈小灶性或点状散在分布于其他癌细胞中;(3)在苏木精-伊红染色切片中CD44^+/SOX2^+细胞体积小,呈圆形、椭圆形结构,胞浆少,核大,核仁明显,核分裂象少见;(4)CD44^+/SOX2^+的表达与结直肠癌患者年龄、性别、部位及浸润深度均无相关性,与分化程度呈负相关,与TNM分期、远处转移均呈正相关;(5)结果提示,CD44^+/SOX2^+细胞的分布、形态特征等符合肿瘤干细胞特性,CD44^+/SOX2^+可能是结直肠癌肿瘤干细胞标志物。