基于网络药理学和实验验证探讨大补肝汤治疗广泛性焦虑症的作用机制

基于网络药理学、分子对接和动物实验探讨大补肝汤治疗广泛性焦虑症(generalized anxiety disorder, GAD)的作用机制。通过网络药理学和分子对接获得大补肝汤治疗GAD的可能靶点和相关信号通路。建立GAD大鼠模型,随机分组后相应药物灌胃,连续干预28 d后检测各组大鼠焦虑状态,并检测大鼠海马病理改变,采用酶联免疫吸附法(ELISA)、蛋白免疫印迹法(Western blot)检测相关蛋白表达水平。初步筛选共得到大补肝汤中化合物65种,作用靶点403个,GAD疾病靶点7 398个,“药物-疾病”共有靶点279个,蛋白-蛋白互作(protein-protein interaction, PPI)网络关键节点为丝氨酸和苏氨酸激酶1(Akt1)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)、白细胞介素(interleukin, IL)-6、细胞肿瘤抗原p53(tumor protein 53,TP53)、IL-1β等;基因本体论(Gene Ontology, GO)功能分析与京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析显示,PI3K-Akt信号通路是最主要途径。分子对接显示,药物核心成分与对应关键靶点均具有较好的结合活性。动物实验显示,大补肝汤可有效改善大鼠焦虑行为,增加大鼠在高架十字迷宫中开臂端运动距离及总距离、进入明箱次数及停留时间、进入旷场中央时间百分比及次数。苏木精-伊红(HE)染色、尼氏染色显示,大鼠海马神经细胞数量增加,排列紧密,细胞体损坏改善,细胞中尼氏体增加,海马组织中TNF-α、IL-6、IL-1β表达下降,TP53、磷酸化丝氨酸和苏氨酸激酶1(p-Akt1)、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)表达上升,其机制可能与激活PI3K-Akt信号通路、抑制炎症反应有关。结果表明,大补肝汤对GAD起到很好的治疗调控作用,体现了中药复方整体作用和多靶点、多通路的特点。同时,初步探讨了大补肝汤治疗GAD可能通过激活PI3K-Akt信号通路,抑制炎症反应、抗细胞凋亡,从而改善GAD状态,为大补肝汤的临床应用提供实验数据支持。

脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠模型的建立

目的建立脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠模型。方法通过灌服大黄水煎液、肌肉注射氢化可的松并结合TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)混合乙醇灌肠建立脾肾阳虚型UC动物模型。将60只大鼠随机分为空白组、脾肾阳虚型UC模型7、14 d及21 d组,采用酶联免疫法检测各组大鼠血清中FT3、FT4、T的含量。结果与空白组比较,脾肾阳虚型UC模型7、14 d及21 d组大鼠血清中FT3、FT4、T的含量均有降低(P<0.05);尤以模型21 d组差异显著。结论 FT3、FT4、T是脾肾阳虚的敏感指标,检测血清FT3、FT4、T可以更好地佐证脾肾阳虚;证明了脾肾阳虚型UC动物模型复建成功。

阿魏酸对人胃癌MGC-803细胞增殖的影响

目的观察阿魏酸对人胃癌MGC-803细胞增殖的影响,探讨其诱导胃癌细胞凋亡的作用机制。方法不同浓度阿魏酸干预体外培养人胃癌MGC-803细胞,作用24、48、72 h后,MTT法检测细胞增殖;不同浓度(0、5、7.5、10 mg/m L)阿魏酸作用MGC-803细胞48 h,Annexin V-FITC/PI法和流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-q PCR和Western-blot检测Capase-3、Capase-9、Bax、Bcl-2和Xiap的m RNA和蛋白表达。结果与对照组比较,5、7.5、10、12.5 mg/m L阿魏酸作用MGC-803细胞的OD值明显降低,阿魏酸抑瘤作用明显,阿魏酸作用MGC-803细胞24、48、72 h的IC50分别为12.93、9.73、5.52 mg/m L;5、7.5、10 mg/m L阿魏酸作用MGC-803细胞48 h后均能诱导MGC-803细胞凋亡,5、7.5、10 mg/m L阿魏酸均能上调Capase-3、Capase-9和Bax的m RNA和蛋白表达,下调Bcl-2和Xiap的m RNA和蛋白表达。结论阿魏酸能有效抑制MGC-803细胞增殖,并能诱导MGC-803细胞凋亡,其作用机制与内源性线粒体凋亡途径和下调Xiap的表达有关。

黄芩苷对胃癌BGC-823、MGC-803细胞迁移能力的影响

目的观察黄芩苷对胃癌BGC-823、MGC-803细胞迁移的影响,探讨其可能的作用机制。方法划痕实验和Transwell小室观察Toll样受体(TLR)激活后以及黄芩苷干预TLR激活后胃癌BGC-823、MGC-803细胞迁移能力;RT-q PCR和Western blot检测胃癌BGC-823、MGC-803细胞的TLR4、激活蛋白-1(AP-1)、血管内皮生长因子(VEGF)m RNA和蛋白表达。结果脂多糖(LPS)可促进胃癌BGC-823、MGC-803细胞迁移,黄芩苷可抑制LPS干预后胃癌BGC-823、MGC-803细胞迁移;LPS可上调TLR4、AP-1、VEGF m RNA和蛋白表达,黄芩苷可下调LPS干预后胃癌BGC-823、MGC-803细胞的TLR4、AP-1、VEGF m RNA和蛋白表达。结论黄芩苷可阻断TLR4-AP-1-VEGF的激活,从而抑制胃癌BGC-823、MGC-803细胞的迁移。

拆方研究逍遥散对阿尔茨海默病模型小鼠记忆功能及血清SOD、MDA、ChAT、AchE活性的影响

目的研究逍遥散对氢溴酸东莨菪碱致阿尔茨海默病模型小鼠记忆功能及血清SOD、MDA、ChAT、AchE活性的影响,探讨逍遥散防治阿尔茨海默病的作用及其机制,阐释疏肝、养血、健脾三者结合防治阿尔茨海默病的配伍意义。方法60只SPF级KM小鼠随机分为空白组、模型组、逍遥散全方组、疏肝养血组、疏肝健脾组、养血健脾组等6组,每组10只。腹腔注射氢溴酸东莨菪碱复制阿尔茨海默病小鼠模型并分别以逍遥散全方及各配伍药组进行干预防治,给药第6、8天进行学习能力训练,第10天进行记忆功能测试,然后股动脉取血测定血清SOD、MDA、ChAT、AchE活性。结果逍遥散全方组、疏肝养血组、疏肝健脾组、养血健脾组皆可提高小鼠记忆潜伏时间,降低错误次数,提高血清SOD、ChAT活性,降低MDA、AchE活性,但记忆功能及血清SOD、MDA、ChAT、AchE的改善皆以逍遥散全方组最为明显。结论逍遥散能较好的改善阿尔茨海默病模型小鼠记忆功能、抗氧化能力及中枢神经递质活性,对阿尔茨海默病具有较好的防治作用,其疏肝、养血、健脾的结合配伍是有效防治阿尔茨海默病的组方结构。

脂多糖对胃癌细胞mir-146a-5p、mir-335-5p及TLR_(1～10)受体表达的影响

目的 研究胃癌细胞在受到脂多糖干预后,TLR_（1~10）受体及上游调控分子mir-335-5p和mir-146a-5p的表达规律。方法 PCR Array筛选结合实时荧光定量PCR检测验证TLR_（1~10）mRNA在不同分化程度胃癌细胞中的表达;实时荧光定量PCR检测不同浓度的脂多糖（终浓度分别为0.1、1.0、10.0、100.0μg/mL）干预胃癌SGC-7901、BGC-823细胞和GES-1细胞12、24、48h后,mir-335-5p、mir-146a-5p及TLR_（1~10）的表达。结果 实时荧光定量PCR检测验证表明,除TLR_1、TLR_3、TLR_5外,其余的Toll样受体mRNA在不同分化程度胃癌细胞中的表达相对于正常胃黏膜上皮GES-1细胞出现明显上调;不同浓度的脂多糖干预胃癌SGC-7901、BGC-823细胞和GES-1细胞12、24、48h后,相对于未干预胃癌细胞,mi-335-5p和mir-146a-5p的表达明显下调;在SGC-7901细胞中,除TLR_3、TLR_4外,其他TLR受体在不同浓度脂多糖干预后,均有不同程度的上调表达;在BGC-823细胞中,TLR_1、TLR_4、TLR_6受体仅在高浓度脂多糖干预时,上调表达,其他TLR受体在不同浓度脂多糖干预后,均有不同程度的上调表达;在GES-1细胞,所有TLR_（1~10）在不同浓度脂多糖干预后均有明显上调表达。结论 脂多糖干预胃癌细胞,可诱导mir-335-5p、mir-146a-5p下调表达和Toll样受体mRNA上调表达,Toll样受体mRNA上调表达可能与mir-335-5p、mir-146a-5p下调有关。

抗体芯片筛选黄芩苷诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡的作用靶点

目的采用凋亡抗体芯片筛选黄芩苷诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡的作用通路和靶点,探讨黄芩苷诱导胃癌细胞凋亡的相关机制。方法采用MTT法检测黄芩苷对SGC-7901细胞的增殖抑制作用;采用流式细胞术检测细胞凋亡情况;采用人凋亡抗体芯片双抗体夹心检测法筛选出黄芩苷(120μmo L·L^(-1))组与对照组的差异表达蛋白;采用Western Blot法对筛选出的差异蛋白Caspase-3、Caspase-8、Fas L、XIAP进行验证,增加对Fas、Caspase-9、TRAIL蛋白的检测。结果与对照组比较,20~320μmo L·L^(-1)的黄芩苷在24~96 h不同时间点可抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖(P<0.05,P<0.01,P<0.001),且呈浓度和时间依赖性;80,120,160μmo L·L^(-1)黄芩苷均可诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡(P<0.01),且呈浓度依赖性;凋亡抗体芯片检测结果表明,120μmo L·L^(-1)黄芩苷组的bad、Caspase-3、Caspase-8、Fas L、HSP60、TRAIL R4、IGF-I、IGF-II、p21、p27、p53和SMAC等蛋白表达明显上调,而XIAP蛋白表达显著下调,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。Western Blot验证实验结果表明,160μmo L·L^(-1)浓度组的Fas L蛋白相对表达量显著上升(P<0.001);120,160μmo L·L^(-1)浓度组的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Fas、TRAIL蛋白相对表达量显著上升(P<0.01,P<0.001),XIAP蛋白相对表达量显著下调(P<0.001)。结论黄芩苷诱导胃癌细胞凋亡的抗肿瘤作用机制与Fas L、TRAIL介导的死亡受体有关;抗体芯片是有效的靶点筛选手段,可用于药物作用靶点和药理机制研究。

当归贝母苦参丸加味方对荷瘤小鼠H22肝癌肿瘤组织MMP13和bFGF表达的影响

目的研究当归贝母苦参丸加味方对H22荷瘤小鼠瘤组织基质金属蛋白酶13(MMP13)和成纤维细胞生长因子2(bFGF)表达的影响。方法建立H22荷瘤小鼠模型进行体内抗肿瘤试验,将60只荷瘤小鼠随机分为模型组,顺铂阳性对照组,当归贝母苦参丸加味方高、低剂量组,当归贝母苦参丸加味方高、低剂量联合顺铂组,连续灌胃给药14d,观察肿瘤生长情况以及小鼠一般情况,肿瘤大体标本及HE染色后组织形态观察;RT-qPCR和免疫组织化学技术分别检测肿瘤组织中MMP13和bFGF的表达。结果大体观察剥离的肿瘤瘤体发现,模型组与中药低剂量组瘤体较大,瘤体内有溃烂,包膜基本完整;各治疗组瘤体较模型组相比较小,但包膜不完整,有不同程度溃烂,剥离易出血,当归贝母苦参丸加味方高、低剂量联合顺铂组瘤体小,包膜完整,肿瘤溃烂较少;HE染色病理形态观察发现,各治疗组结缔组织明显,细胞稀疏程度增加,坏死癌细胞数目增加。RT-qPCR检测显示,与模型组相比,各用药组中MMP13和bFGF mRNA的表达量均降低,差异有统计学意义(P<0.05);免疫组化检测显示,MMP13和bFGF在当归贝母苦参丸加味方高、低剂量联合顺铂组中蛋白着色变浅,呈弱阳性表达,当归贝母苦参丸加味方高、低剂量联合顺铂组较单独用药蛋白表达量低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论当归贝母苦参丸加味方可以在mRNA和蛋白水平下调荷瘤小鼠肿瘤组织中MMP13和bFGF的表达,进而抑制肿瘤侵袭和血管生成,发挥抑瘤减毒增效目的。

miR-20a-5p/miR-20b-5p在胃癌细胞和组织中的表达及调控靶基因信号通路富集分析

目的观察miR-20a-5p/miR-20b-5p在胃癌细胞和胃癌组织中的表达,并用生物信息学方法分析其靶基因和富集的信号通路,探讨其生物学行为和功能。方法采用实时荧光定量PCR法检测miR-20a-5p/miR-20b-5p在不同分化程度(高、中、低)的胃癌细胞和正常胃黏膜细胞以及其在胃癌组织和癌旁组织中的表达水平,并分析其临床意义,采用mir WALK网站数据库的预测软件预测其靶基因,选择该网站10个软件中具备3个以上软件支持的靶基因,用DAVID 6.7在线富集其靶基因参与的信号通路。结果 miR-20a-5p/miR-20b-5p在不同分化程度(高、中、低)的胃癌细胞中表达上调(P均<0.05),胃癌组织相对于癌旁组织亦明显上调表达(P<0.05),miR-20b-5p表达上调与胃癌淋巴结侵袭转移以及浸润深度关系密切(P均<0.05);生物信息学分析提示,miR-20a-5p/miR-20b-5p的靶基因富集存在于肿瘤相关的多个信号通路中。结论 miR-20a-5p/miR-20b-5p在胃癌细胞系及组织中呈高表达,并于与淋巴结侵袭转移以及浸润深度有关,可作为胃癌潜在的生物学标志物。

归芪聪志汤对血管性痴呆模型大鼠行为学和海马组织基因表达谱的影响

目的研究归芪聪志汤对血管性痴呆(Vasculardementia,VD)大鼠模型海马基因表达谱的影响及部分筛选基因表达的影响。方法从120只SPF级Wistar雌性大鼠中随机选取10只作为假手术组,其余均采用改良后的两血管阻断法改良法制备血管性痴呆大鼠模型,经水迷宫筛选出合格造模大鼠35只,随机区组分为假手术组,模型组,阳性对照组,归芪聪志汤高、中、低剂量组。归芪聪志汤连续灌胃4周后处死大鼠取材海马组织。Morris水迷宫检测造模后及治疗后行为学变化。全基因组表达谱芯片检测归芪聪志汤中剂量组与模型组海马组织之间差异表达的基因;RT-qPCR检测紧密连接蛋白-1,2,3,14,22(claudin-1,claudin-2,claudin-3,claudin-14,claudin-22),细胞黏附分子(ICAM),血管紧张素转化酶(ACE)的mRNA表达量。结果Morris水迷宫检测显示:模型鼠逃避潜伏期明显延长,跨原平台次数明显减少(P<0.01)。治疗28d后模型组逃避潜伏期明显延长,跨原平台次数明显减少(P<0.05);与模型组相比,各治疗组大鼠逃逸潜伏期均缩短,跨原平台次数均增多(P<0.01),其中归芪聪志汤中剂量组、阳性药物对照组大鼠学习记忆能力改善情况优于归芪聪志汤高、低剂量组(P<0.05)。基因芯片和RT-qPCR检测结果显示:与假手术组比较,模型组claudin-1,claudin-2,claudin-3,claudin-22,ICAM,ACE基因表达量均升高(P<0.05,P<0.01),claudin-14、CDH3基因表达量均下降(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,各治疗组claudin-1,claudin-2,claudin-3,claudin-22,ICAM,ACE基因表达量均下降,claudin-14,CDH3基因表达量均升高,其中,归芪聪志汤中剂量组、阳性药物对照组优于归芪聪志汤高、低剂量组(P<0.05)。结论归芪聪志汤能下调VD模型大鼠海马组织claudin-1,claudin-2,claudin-3,claudin-22,ICAM,ACE的表达,并升高claudin-14,CDH3的表达,从而发挥抗VD作用。

加味当归贝母苦参丸对胃癌荷瘤鼠肿瘤组织VEGFA、MMP13和TGF-β表达的影响

目的:研究当归贝母苦参丸加味方对MFC胃癌荷瘤小鼠瘤组织VEGFA、MMP13和TGF-β表达的影响。方法:建立MFC胃癌荷瘤小鼠模型进行体内抗肿瘤试验,将筛选合格的48只MFC胃癌荷瘤小鼠随机分为模型组、顺铂阳性对照组、加味当归贝母苦参丸高、低剂量组、顺铂联合加味当归贝母苦参丸高、低剂量组,连续灌胃给药14 d,治疗结束后,处死大鼠,RT-q PCR和免疫组织化学技术分别检测肿瘤组织中VEGFA、MMP13和TGF-β的表达。结果:与模型组相比,各用药组中VEGFA、MMP13和TGF-βmRNA和蛋白的表达量均降低;VEGFA、MMP13和TGF-β在联合组中蛋白着色变浅,呈弱阳性表达,联合用药组较顺铂组、当高、低组蛋白表达量降低。结论:当归贝母苦参丸加味方可以下调荷瘤小鼠肿瘤组织VEGFA、MMP13和TGF-β的表达,进而发挥抗肿瘤作用。

黑逍遥散调控p38MAPK/Beclin-1/Bcl-2通路对阿尔茨海默病模型大鼠自噬水平的影响

探究黑逍遥散对阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)自噬水平的影响。100只4月龄Wistar雄性大鼠,随机选取10只作为空白组,10只假手术组双侧海马注射1μL生理盐水,其余大鼠海马注射Aβ_(1-42)溶液复制AD模型,挑选造模成功大鼠50只,随机分为模型组、安理申组(0.5 mg·kg^(-1))及黑逍遥散高、中、低剂量组(15.30、7.65、3.82 g·kg^(-1)),每组10只,连续灌胃42 d。Morris水迷宫测试大鼠学习记忆能力,Hoechst染色观察海马CA1区神经细胞病理变化,RT-qPCR检测p38MAPK、Beclin-1、Bcl-2 mRNA表达,Western blot检测p38MAPK、Beclin-1、Bcl-2、APP及相关蛋白表达,ELISA法检测大鼠海马Aβ_(1-42)水平,免疫组化检测海马区LC3Ⅱ表达水平。实验结果显示,与空白组比较,模型组大鼠学习记忆能力下降(P<0.01),海马CA1区神经细胞核形态呈蓝色高亮斑,排列紧密,p38MAPK mRNA表达上调、Beclin-1 mRNA、Bcl-2 mRNA表达下调(P<0.01),p38MAPK、p-p38MAPK、APP表达增高,Beclin-1、Bcl-2、p-Bcl-2蛋白表达下降(P<0.01),Aβ_(1-42)表达增高(P<0.01),LC3Ⅱ相对表达下降(P<0.01)。与模型组比较,各给药组大鼠学习记忆能力改善(P<0.05或P<0.01),海马CA1区神经细胞核形态逐渐清晰,呈淡蓝色,p38MAPK mRNA表达下调(P<0.01),Beclin-1 mRNA、Bcl-2 mRNA表达提高(P<0.05或P<0.01),p38MAPK、p-p38MAPK、APP表达下调,Beclin-1、Bcl-2、p-Bcl-2蛋白表达上调(P<0.05或P<0.01),Aβ_(1-42)表达均下降(P<0.01),LC3Ⅱ相对表达上调(P<0.01)。由此可得,黑逍遥散可改善AD模型大鼠认知能力,其潜在机制可能与调控p38MAPK/Beclin-1/Bcl-2信号通路,提升自噬水平,减少Aβ_(1-42)积聚有关。

黑逍遥散通过MKP-1/JNK通路改善阿尔茨海默病大鼠的研究

目的探究黑逍遥散调控丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)/c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路干预阿尔茨海默病(AD)大鼠海马Tau蛋白表达、抑制神经炎症的作用,及其作用机制。方法将SPF级Wistar雄性大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组、对照组和低、中、高剂量实验组,每组10只。除空白组和假手术组外,其余5组大鼠双侧海马区注射β-淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)溶液复制AD大鼠模型,假手术组相同方法注射等量0.9%NaCl。将造模成功的大鼠随机分为模型组、对照组(0.5 mg·kg^(-1)盐酸多奈哌齐)和低、中、高剂量实验组(3.82、7.65、15.30 g·kg^(-1)黑逍遥散汤剂)。空白组、假手术组和模型组均灌胃给予等体积的0.9%NaCl。7组大鼠每天灌胃1次,连续灌胃给药42 d。用Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力,用酶联免疫吸附试验法检测海马组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)水平,用蛋白质印迹法检测MKP-1、磷酸化JNK(p-JNK)、磷酸化Tau(p-Tau)蛋白的表达水平。结果中、高剂量实验组和对照组、模型组、假手术组、空白组第5天逃避潜伏期分别为(8.28±7.67)、(7.89±4.18)、(7.86±2.68)、(16.55±4.16)、(6.46±3.30)和(3.60±1.53)s,TNF-α水平分别为(406.56±28.44)、(404.17±22.84)、(402.28±28.36)、(665.89±61.15)、(226.44±34.84)和(218.50±30.16)pg·mL^(-1),IL-6水平分别为(136.54±7.04)、(121.67±5.19)、(119.15±5.87)、(166.27±8.91)、(88.75±5.28)和(79.58±7.53)ng·L^(-1),MKP-1蛋白相对表达水平分别为2.31±0.34、2.59±0.38、2.58±0.37、1.23±0.25、2.64±0.19和2.84±0.18,p-JNK蛋白相对表达水平分别为3.46±0.35、3.45±0.31、3.20±0.23、4.48±0.30、2.87±0.51和2.30±0.26,p-Tau蛋白相对表达水平分别为3.46±0.33、3.24±0.48、3.09±0.31、4.85±1.06、2.69±0.34和2.40±0.55。中、高剂量实验组的上述指标与模型组比较,在统计学上差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论黑逍遥散可显著改善AD大鼠的学习记忆能力,其作用机制可能与调控MKP-1与JNK蛋白,从而抑制Tau蛋白磷酸化水平、减轻神经炎症有关。

当归贝母苦参丸含药血清对胃癌细胞SGC-7901抑制作用机制的研究

目的:研究不同浓度当归贝母苦参丸含药血清抑制胃癌细胞SGC-7901的机制。方法:将120只Wistar大鼠分为当归贝母苦参丸高、中、低剂量组(0.3,0.2,0.1 g·kg^(-1))和正常组,每组30只,ig 2次/d,连续给药7 d,制备含药血清,以空白血清处理胃癌细胞SGC-7901为空白组,实验组以当归贝母苦参丸含药血清高、中、低剂量组处理SGC-7901细胞后用RTq PCR技术检测环氧合酶-2(COX-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),人第10号染色体缺失的磷酸酶(PTEN)mRNA表达水平、用免疫细胞化学技术检测COX-2,BAX,PTEN蛋白表达情况。结果:与正常组比较,高剂量组使SGC-7901细胞COX-2 mRNA的表达量下降68%,BAX和PTEN mRNA的表达量分别升高99.7%和85.6%(P<0.05),含药血清可以降低SGC-7901细胞COX-2的阳性表达率,升高其平均灰度值,升高BAX和PTEN的阳性表达率,减低其平均灰度值(P<0.05)。结论:当归贝母苦参丸含药血清能抑制胃癌细胞SGC-7901,BAX,PTEN,COX-2 mRNA和蛋白的表达。

逍遥散对D-半乳糖致阿尔茨海默病模型小鼠记忆功能及血清SOD、MDA、ChAT、AchE的影响

目的:研究逍遥散对D-半乳糖所致阿尔茨海默病模型小鼠记忆能力及血清SOD、MDA、Ch AT、Ach E活性的影响,探讨逍遥散防治阿尔茨海默病的作用及其机制。方法:50只SPF级KM小鼠随机分为空白组,模型组,逍遥散低、中、高剂量组,每组10只。腹腔注射D-半乳糖复制阿尔茨海默病小鼠模型并以逍遥散不同剂量进行干预防治,给药第41天进行学习能力训练,第42天进行记忆功能测试,然后股动脉取血测定血清SOD、MDA、Ch AT、Ach E活性。结果:逍遥散低、中、高剂量组均可提高小鼠记忆潜伏时间,降低错误次数,提高血清SOD、Ch AT活性,降低MDA、Ach E活性,但记忆功能及血清SOD、MDA、Ch AT、Ach E的改善皆以逍遥散高剂量组最为明显。结论:逍遥散能较好的改善阿尔茨海默病模型小鼠记忆功能、抗氧化能力及中枢神经递质活性,对阿尔茨海默病具有较好的防治作用。

黄芩苷抑制人胃癌MGC-803和BGC-823细胞的迁移及分子机制

目的 :观察黄芩苷对人胃癌细胞株MGC-803和BGC-823细胞迁移能力的影响,并探讨可能的作用机制。方法 :应用细胞划痕愈合实验和Transwell小室迁移实验观察黄芩苷对MGC-803和BGC-823细胞迁移能力的影响。分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测p53、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)、组织金属蛋白酶抑制因子(3tissue inhibitor of metalloproteinase 3,TIMP3)以及基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinase-3,MMP3)mR NA和蛋白的表达水平。结果:黄芩苷能明显抑制MGC-803和BGC-823细胞的迁移能力(P值均<0.01)。实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测结果显示,黄芩苷可上调MGC-803和BGC-823细胞中p53、PTEN和TIMP3 mRNA以及蛋白的表达水平,而下调MMP3 mRNA和蛋白的表达水平(P值均<0.01)结论 :黄芩苷可抑制人胃癌MGC-803和BGC-823细胞的迁移,其作用机制与上调p53、PTEN和TIMP3的表达及下调MMP3的表达有关。

基于PP2A与GSK-3β探讨丹栀逍遥散对阿尔茨海默病模型大鼠tau蛋白磷酸化水平的作用机制

目的:研究丹栀逍遥散对阿尔茨海默病(AD)大鼠海马中tau蛋白磷酸化水平与糖原合成激酶-3β(GSK-3β)、磷酸丝氨酰/磷酸苏安酰蛋白磷酸酶2A(PP2A)不同位点的影响及作用机制。方法:选用90只SPF级Wistar雄性大鼠,用双侧海马区注射冈田酸的方式建立AD大鼠模型。筛选出造模成功的大鼠,随机分为模型组,安理申组(0.5 mg·kg^(-1)),丹栀逍遥散高、中、低剂量组(17.55、8.77、4.38 g·kg^(-1)),连续灌胃42 d,1次/d。Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力,尼氏染色观察海马区神经元形态结构,实时荧光定量聚合链式反应(Real-time PCR)检测tau蛋白、GSK-3β、PP2A mRNA表达情况,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测tau蛋白、GSK-3β、PP2A及相关蛋白的表达。结果:与空白组比较,模型组大鼠学习记忆能力显著降低(P<0.01),海马CA3区细胞结构异常,排列杂乱,数量减少,GSK-3βmRNA、GSK-3β、p-GSK-3β-Tyr216、p-PP2A、p-tau表达均显著增高(P<0.01),p-GSK-3β-Ser9、PP2A的表达量显著减少(P<0.01)。与模型组比较,安理申组及丹栀逍遥散各组学习记忆能力均改善(P<0.05,P<0.01),海马CA3区细胞形态及数量优于模型组;安理申组PP2A、tau mRNA明显上调(P<0.05),GSK-3βmRNA显著下调(P<0.01),GSK-3β、p-GSK-3β-Tyr216、p-PP2A蛋白表达明显下调(P<0.05,P<0.01),PP2A蛋白表达显著上调(P<0.01);丹栀逍遥散高剂量组PP2AmRNA显著上调(P<0.01),GSK-3βmRNA显著下调(P<0.01),p-PP2A、p-GSK-3β-Tyr216、p-tau蛋白表达下调(P<0.05,P<0.01),PP2A蛋白表达显著上调(P<0.01);丹栀逍遥散中剂量组GSK-3βmRNA显著下调(P<0.01),GSK-3β、p-GSK-3β-Tyr216、p-tau蛋白表达下调(P<0.05,P<0.01),PP2A蛋白表达显著上调(P<0.01);丹栀逍遥散低剂量组PP2A mRNA显著上调(P<0.01),GSK-3βmRNA显著下调(P<0.01),GSK-3β、p-GSK-3β-Tyr216蛋白表达下调(P<0.05,P<0.01),p-GSK-3β-Ser9、PP2A蛋白表达显著上调(P<0.01)。结论:丹栀逍遥散可改善AD大鼠的学习记忆能力,其机制可能与调控GSK-3β与PP2A蛋白相关位点活性及tau蛋白磷酸化水平有关。

石榴健胃片对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎模型大鼠结肠炎症因子的影响

目的研究石榴健胃片对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎(SKD-UC)模型大鼠结肠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6和IL-10的影响。方法采用15%大黄混悬液灌胃联合2,4,6-三硝基苯磺酸-乙醇溶液灌肠的病证结合法建立SKD-UC大鼠模型,将模型大鼠随机分为阳性组,模型组,石榴健胃片高、中、低剂量组,每组20只,另取20只作为空白组。造模成功后第2天开始进行药物干预,阳性组大鼠灌胃柳氮磺胺吡啶(SASP,0.36g/kg),石榴健胃片高、中、低剂量组分别灌胃石榴健胃片混悬液2.4,1.2,0.6g/kg,模型组和空白组灌胃等体积生理盐水,每天1次,连续21d。末次给药后24h处死大鼠,取结肠组织,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测结肠组织中IL-1β,IL-6,IL-10,TNF-α的基因表达。结果与空白组比较,模型组大鼠结肠IL-1β,IL-6,TNF-α的mRNA相对表达量明显增高,IL-10的mRNA相对表达量明显降低,组间比较差异均有高度统计意义(P<0.01);与模型组比较,石榴健胃片高、中、低剂量组大鼠结肠IL-1βmRNA和TNF-αmRNA相对表达量明显降低(P<0.05或P<0.01),高、中剂量组IL-6mRNA相对表达量明显降低(P<0.01),而高、中、低剂量组IL-10mRNA相对表达量明显升高(P<0.05或P<0.01);与阳性组比较,石榴健胃片高剂量组大鼠结肠IL-1β,TNF-α和IL-6的mRNA相对表达量及中剂量组IL-1βmRNA相对表达量明显降低(P<0.05),高、中剂量组IL-10mRNA相对表达量明显升高(P<0.05);各剂量组之间IL-1β,IL-6,TNF-α和IL-10的mRNA相对表达量比较差异均无统计意义(P>0.05)。结论石榴健胃片对SKD-UC模型大鼠的结肠TNF-α,IL-1β,IL-6及IL-10的基因表达具有调节作用。

黑逍遥散调控NOX2/ROS/NF-κB信号通路干预AD模型小鼠小胶质细胞极化

基于氧化酶2(NADPH oxidase 2,NOX2)/活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)/核转录因子κB(nuclear factor kappaB,NF-κB)信号通路探究黑逍遥散对APP/PS1双转基因小鼠小胶质细胞(microglia,MG)极化的影响及作用机制。4月龄雄性APP/PS1双转基因小鼠50只,随机分为模型组、MCC950组(10 mg·kg-1)及黑逍遥散低、中、高剂量组(6.45、12.89、25.78 g·kg-1),同月龄、同系种雄性C57BL/6J小鼠30只,随机分为空白组、空白灌胃干预组和空白腹腔注射组,各组给药干预90 d。Morris水迷宫检测学习认知能力,尼氏染色和透射电镜观察海马神经元病理形态和超微结构,免疫荧光检测小胶质细胞M1型标志物CD16/32+/Iba-1^(+)、M2型标志物CD206^(+)/Iba-1^(+)的阳性表达及海马ROS表达情况,比色法检测海马丙二醛(malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)含量,酶联免疫吸附法检测海马白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)炎症因子含量,蛋白免疫印迹检测海马β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)、Iba-1、CD16/32、CD206、NOX2、NF-κB、p-NF-κB、核因子κB抑制蛋白α(NF-κB inhibitor alpha,IκBα)和p-IKBα蛋白表达。结果显示,与空白组比较,模型组小鼠目标象限运动距离、逃避潜伏期显著延长(P<0.01),目标象限滞留时间及百分比显著缩短(P<0.01);神经元细胞排列紊乱,出现肿胀、核消失或偏置,细胞数量明显减少,尼氏小体溶解甚至消失,胞质呈透亮区域;细胞膜出现缺损、皱缩,形态异常,胞质中少见细胞器,线粒体明显肿大,数量减少;小胶质细胞M1型标志物CD16/32+/Iba-1^(+)显著升高(P<0.01),M2型标志物CD206^(+)/Iba-1^(+)显著降低(P<0.01),ROS活性和MDA含量显著升高(P<0.01),SOD水平显著降低(P<0.01),炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α含量显著升高(P<0.01);Aβ、CD16/32、Iba-1、NOX2、NF-κB和IKBα蛋白表达及磷酸化显著升高(P<0.01),CD206显著降低(P<0.01)。空白组与空白灌胃干预组、空白腹腔注射组差异无统计学意义。黑逍遥散干预后,各剂量组小鼠目标象限运动距离和逃避潜伏期显著缩短(P<0.01),目标象限滞留时间及百分比显著延长(P<0.01);细胞数量明显增多,排列较为整齐,肿胀明显缓解,尼氏小体增加;细胞形态较为规则,胞膜较为完整,线粒体肿胀明显缓解,但仍有部分内质网轻度扩张;M1型标志物CD16/32+/Iba-1^(+)显著降低(P<0.05或P<0.01),M2型标志物CD206^(+)/Iba-1^(+)显著升高(P<0.01),ROS活性、MDA含量显著降低(P<0.01),SOD水平显著升高(P<0.01),炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α含量显著降低(P<0.01);Aβ、CD16/32、Iba-1、NOX2、NF-κB、IKBα蛋白及其磷酸化显著降低(P<0.01),CD206显著升高(P<0.01)。综上所述,黑逍遥散能够缓解神经元损伤,提高APP/PS1小鼠学习记忆能力,作用机制可能与抑制NOX2/ROS/NF-κB信号通路,调节MG极化,增加M2型表达,抑制M1型表达,减少炎症因子释放有关。

归芪聪志汤对血管性痴呆模型大鼠大脑皮层线粒体功能的影响

目的研究归芪聪志汤对血管性痴呆(VD)模型大鼠大脑皮层线粒体功能的影响。方法将120只大鼠称重,进行水迷宫测试,剔除不合格大鼠10只,使用区组随机法选出10只大鼠作为假手术组,其余大鼠采用两血管阻断改良法制备VD大鼠模型,经Morris水迷宫筛选出造模成功的大鼠,随机分为模型组,阳性药物对照组,归芪聪志汤高、中、低剂量组。各组给予相应的药物或蒸馏水灌胃4周后,HE染色观察海马神经细胞的损伤情况,采用比色法检测大鼠海马组织及大脑皮层其他部位线粒体复合物的活性及三磷酸腺苷(ATP)的含量。结果与假手术组比较,模型组海马神经细胞损伤程度严重;与模型组比较,各治疗组海马神经细胞损伤程度均减轻,其中归芪聪志汤中剂量组海马神经细胞损伤程度改善最为明显。与假手术组比较,模型组海马组织及大脑皮层其他部位线粒体复合物Ⅰ~Ⅴ的活性及ATP含量均明显降低(P<0.05)。与模型组比较,阳性药物对照组与归芪聪志汤中剂量组大鼠海马组织线粒体复合物Ⅰ~Ⅴ的活性及ATP含量明显升高,除归芪聪志汤中剂量组的线粒体复合物Ⅰ与模型组比较差异无统计意义外,其他均有统计意义(P<0.05);阳性药物对照组与归芪聪志汤中剂量组大鼠大脑皮层其他部位线粒体复合物Ⅰ~Ⅴ的活性均升高,其中线粒体复合物Ⅰ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ差异有统计意义(P<0.05),ATP含量均降低,但差异无统计意义(P>0.05)。与阳性药物对照组比较,归芪聪志汤中剂量组大鼠海马组织线粒体复合物Ⅴ的活性明显升高(P<0.05);归芪聪志汤中剂量组大脑皮层其他部位线粒体复合物Ⅰ活性明显升高,线粒体复合物Ⅴ活性明显降低,差异均有统计意义(P<0.05)。结论归芪聪志汤能明显改善VD模型大鼠海马组织病变,其作用机制与改善海马组织和大脑皮层其他部位线粒体复合物Ⅰ~Ⅴ的活性及ATP含量有关。