山黧豆AAE超家族基因鉴定及LsAAE3的酶活检测

【目的】三七素(β-N-草酰-L-α,β-二氨基丙酸,β-ODAP)是山黧豆、三七等物种中的神经活性物质,其生物合成与草酰辅酶A密切相关。研究基于全基因组鉴定山黧豆草酰辅酶A合成酶的编码基因,为β-ODAP生物合成的调控研究奠定基础。【方法】用AMP结合结构域隐马尔科夫模型在山黧豆基因组中鉴定酰基激活酶超家族(acyl-activating enzyme superfamily,AAE)基因,在此基础上,克隆山黧豆草酰辅酶A合成酶基因LsAAE3,用多序列比对、原核表达及酶活检测等方法分析LsAAE3基因功能。【结果】山黧豆中至少存在22条AAE家族基因;系统发育分析表明:LsAAE3与拟南芥AtAAE3等聚为一支,隶属于酰基辅酶A合成酶家族。基因克隆及序列分析表明:LsAAE3基因cDNA全长为1566 bp;LsAAE3和AtAAE3的保守结构域类似,均含有AMP结合位点、CoA结合位点及AAE保守结构域。SDS-PAGE检测表明所获融合蛋白条带单一,大小在56 kD左右;用His标签抗体进行Western blot分析发现,诱导后和纯化的融合蛋白均能检测到特征条带,说明所获融合蛋白为LsAAE3。体外酶活检测表明:LsAAE3具有草酰辅酶A合成酶活性,其活性发挥依赖于ATP、Mg^(2+)。【结论】研究在全基因组水平鉴定山黧豆AAE超家族基因,并验证了LsAAE3具有草酰辅酶A合成酶活性,为进一步分析山黧豆LsAAE3在β-ODAP生物合成过程中的功能奠定基础。

甘肃耐氨基糖苷类结核分枝杆菌样本相关基因位点的研究

目的了解耐氨基糖苷类结核分枝杆菌临床分离株rrs与rpsl基因突变特征及其与耐药的关系。方法对86株活动性肺结核患者痰标本分离的结核分枝杆菌进行菌型鉴定及结核分枝杆菌药敏试验,利用二代测序技术全基因组测序获得rrs与rpsl基因序列,并对序列比对分析。结果86株多耐药样本中24个样本在rpsl发生了点突变,临床样本药敏结果显示24个点突变样本,其中9个样本突变类型为A263G,15个样本的突变类型为A128G,这些突变位点与链霉素、卡那霉素、阿米卡星、耐卷曲霉耐药相关。同时发现10个样本在rrs基因发生了点突变,1株突变类型为G5T,2株突变类型为A513C,其中1株突变类型为C517T,2株突变类型为T1030C,1株突变类型为A1401G,2株突变类型为C1456T,1株突变类型为G1481T,这些突变位点与链霉素、卡那霉素、阿米卡星、耐卷曲霉耐药相关。结论结核分枝杆菌对氨基糖苷类耐药与rrs和rpsl基因突变有关,突变类型rpslA128G、rpslA263G、rrsC517T、rrsA513C与链霉素耐药相关,突变类型rrsA1401G、rrsG1484T与链霉素、卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素交叉耐药相关。突变类型rrsC1456T与链霉素耐药相关,突变类型尚未见相关文献报道,为新的突变位点。为进一步研究耐药机制以及耐药结核病的快速检测提供了依据。

实时荧光定量PCR检测宫腔脱落细胞中P27^(kip1)及cylin E基因的表达及意义

目的探讨宫腔脱落细胞中P27kip1、cyclin E基因的表达在子宫内膜癌早期诊断中的意义。方法收集健康志愿者及子宫内膜癌患者宫腔脱落细胞样本共80例;提取总RNA,采用实时荧光定量PCR法检测目的基因的表达,比较健康志愿者及子宫内膜癌患者宫腔脱落细胞中P27kip1、cyclin E基因表达量的差异。结果荧光定量PCR结果显示,P27kip1基因在健康志愿者宫腔脱落细胞中的表达显著高于子宫内膜癌患者,差异有统计学意义(P<0.05),并随恶性程度升高,P27kip1的表达水平降低,两者比较差异有统计学意义(P<0.05);cyclin E基因的表达随恶性程度的增高而增高,两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论联合检测P27kip1和cyclin E基因可作为子宫内膜癌早期诊断的依据。

尿nephrin与肌酐比率和RBP-4在2型糖尿病肾病诊断中的意义

目的:探讨尿nephrin与肌酐比率(UNCR)和视黄醇结合蛋白4(RBP-4)在2型糖尿病肾病诊断中的意义。方法:选取2型糖尿病患者110例,正常健康对照组40例。采用定量酶联免疫吸附法(ELISA)测定2组患者尿白蛋白、肌酐、nephrin和RBP-4的含量,依据尿白蛋白与肌酐比率(UACR)将糖尿病患者分为正常白蛋白尿组、微量白蛋白尿组和大量白蛋白尿组,进行UNCR与RBP-4相关性分析。结果:正常白蛋白尿组、微量白蛋白尿组和大量白蛋白尿组UNCR比较差异具有统计学意义(P<0.05);正常白蛋白尿组UNCR阳性率为51.7%,而微量白蛋白尿组和大量白蛋白尿组UNCR阳性率均大于95%,UNCR与RBP-4呈正相关。正常白蛋白尿组、微量白蛋白尿组和大量白蛋白尿组RBP-4含量比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:UNCR和RBP-4在糖尿病早期诊断和预测糖尿病肾病病情进展中有重要的指示作用。

蛋白质组学在高脂血疾病诊断中的研究进展

蛋白质组学在疾病的诊断中起着重要的作用，近年来在高血压、糖尿病、高脂血症等疾病诊断中取得了进步，目前，蛋白质组学在高脂血症中的研究在国内外越来越广泛．尤其是对差异蛋白和功能性蛋白的研究越来越多，构建基于高脂血症蛋白质组的病理图谱．将会揭示许多新的诊断标志物以及新的药物，蛋白质组学近年来已经成为国内外医学领域里的热点研究领域，包括生物体、组织和细胞所表达的全部蛋白质，这便成了分子生物基因组与临床研究的桥梁。

棉花GhTGA2.1基因的克隆表达及功能的初步分析

为了获得棉花GhTGA2.1基因并分析其生物学功能,本研究通过分析枯萎病菌诱导的棉花转录因子,获得1个TGA转录因子基因,命名为GhTGA2.1。该基因ORF全长为1389bp,编码462个氨基酸,序列比对发现GhTGA2.1具有碱性结构域(N-x7-R/K-x9)、亮氨酸拉链结构域(L-x6-L-x6-L)和1个保守的DOG1结构。GhTGA2.1基因编码蛋白分子量为51.12kD,理论等电点为7.88,为亲水的不稳定蛋白,二级结构主要为无规则卷曲和α螺旋。利用实时荧光定量RCR技术(RT-qRCR)分析基因表达水平,发现棉花枯萎病菌诱导GhTGA2.1基因的下调表达;经SA、JA和ET处理后,GhTGA2.1基因表达量相对于mock发生显著变化。为进一步研究该基因功能,构建GhTGA2.1基因过表达载体并进行烟草遗传转化,获得6株转GhTGA2.1基因阳性植株,其抗病相关基因NtPR1、NtPR5、NtNPR1和NtERF1表达量明显低于野生型株系,其中NtPR1和Nt-PR5的相对表达量下降幅度较大;而NtPR4和NtWRKY70的表达量升高,NtPR2的表达量较野生型没有明显差异。本研究通过对棉花的GhTGA2.1转录因子的表达特性以及转烟草的相关基因进行分析,为今后进一步研究该基因的功能,揭示其在棉花抗病中的作用奠定基础。

高压蒸汽灭菌对麦康凯琼脂培养基质量的影响

目的探讨高压蒸汽灭菌对麦康凯琼脂培养基主要质量指标（p H、性能）的影响。方法配制p H为6.80、7.00、7.10、7.20、7.30、7.40、7.50、7.60、7.70、7.80的麦康凯琼脂培养基,经高压蒸汽灭菌后进行p H测定,并将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌和粪肠球菌接种于麦康凯琼脂培养基上,37℃培养24 h,观察不同p H对细菌生长的影响。结果高压蒸汽灭菌后麦康凯琼脂培养基p H降低0.30~0.50。p H为6.78~7.28时,大肠埃希菌生长率≥0.5;p H为6.93~7.39时,鼠伤寒沙门菌生长率≥0.5;不同p H的麦康凯琼脂培养基上金黄色葡萄球菌及粪肠球菌的生长指数均为0。结论高压蒸汽灭菌可影响麦康凯琼脂培养基的p H及性能。

腐皮镰刀菌SYBR Green实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的建立一种能够快速、灵敏、特异的鉴定腐皮镰刀菌的SYBR Green实时荧光定量PCR。方法运用SYBR Green实时荧光定量PCR反应体系检测腐皮镰刀菌,并对此方法的特异性、灵敏度和稳定性进行评价。结果通过对45例样品的检测,结果显示SYBR Green实时荧光定量PCR特异性好,其检出率高于普通PCR;灵敏度高,对重组质粒标准品的检测灵敏度为1.0×10~2copies/μL;稳定性好,对质粒为1.0×10~7copies/μL、1.0×10~5copies/μL、1.0×10~3copies/μL的标准品重复检测10次,结果显示扩增反应Ct值的变异系数为0.96%~1.68%。结论SYBR Green实时荧光定量PCR检测腐皮镰刀菌,不仅特异性好,灵敏度高,稳定性好,而且简便、快速、易操作。

SYBR Green实时荧光定量PCR快速检测口腔幽门螺杆菌

目的建立一种快速、灵敏、特异的鉴定幽门螺杆菌实时荧光定量PCR方法。方法利用SYBR Green实时荧光定量PCR反应体系对口腔幽门螺杆菌进行检测。鉴定结果与临床常规鉴定方法相比较,评价其敏感度、特异度及重复性。结果通过48例样品的检测,结果显示实时荧光定量PCR法检测标本的鉴定结果与常规PCR鉴定方法的结果对比,特异度为100%,敏感度为100%;最小能检测到102个拷贝数的重组质粒;批内重复试验和批间重复试验结果均与常规鉴定方法结果相符。结论实时荧光定量PCR法鉴定口腔幽门螺杆菌,特异度和敏感度高,重复性好,且快速、简便。该方法有望成为检测口腔幽门螺杆菌感染的一种快速有效的方法。

492例细菌性阴道病患者加德纳菌检测与药敏分析

目的了解当地女性细菌性阴道病(BV)患者中阴道加德纳菌(GV)的感染情况以及GV对常用抗菌药物的敏感性,为BV的诊断和治疗提供依据。方法对收集的492例BV患者和151例正常健康妇女的阴道分泌物进行GV的分离培养与鉴定,并对分离菌进行常用抗菌药物敏感性试验。结果 492例BV患者GV阳性率为27.8%,健康妇女GV阳性率为7.9%,两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。分离的GV对万古霉素和克林霉素均较敏感,对头孢噻肟、四环素、左氧氟沙星、氨苄青霉素、红霉素、甲硝唑的敏感性依次降低。结论 GV为当地BV患者的重要病原菌之一,且对万古霉素和克林霉素均较敏感,对甲硝唑的敏感性最低。

太赫兹技术在检测蛋白质类有机化合物的应用进展

太赫兹技术是基于太赫兹(THz)波的远红外波段光谱测量新技术,近年来在医疗诊断、食品检测和生物研究等不同领域中的应用进展迅速。本研究结合THz技术的特点,介绍了近年来利用THz技术在氨基酸、肽和蛋白质的结构、构象、动力学及定量检测等方面取得的进展;比较了不同实验条件下测定的同种氨基酸和肽在THz波段的吸收系数和折射率;阐述了THz技术在研究混合氨基酸的定性、定量分析,氨基酸水溶液的应用以及不同氨基酸的THz波谱存在差异的原因;综述了THz技术研究蛋白质构象、水合动力学、抗原抗体的相互作用和蛋白定量,初步探讨了THz技术在生物医学领域应用中的前景和待解决的问题。

结直肠癌患者血清中微小RNA-29a、微小RNA-92a和癌胚抗原的表达及临床意义

目的测定结直肠癌患者外周血清中微小RNA-29a(miR-29a)、微小RNA-92a(miR-92a)和癌胚抗原的表达水平,探讨其临床意义。方法采用实时荧光聚合酶链反应检测2016年6月—2019年5月南京医科大学附属苏州科技城医院73例结直肠癌患者及73例健康体检志愿者血清miR-29a、miR-92a的表达,化学发光法检测癌胚抗原,分析血清miR-29a、miR-92a诊断结直肠癌的效能。结果血清miR-29a、miR-92a在结直肠癌患者中表达显著高于健康人群(P<0.01),结直肠癌肝转移亚组较无转移亚组显著升高(P<0.01),差异有统计学意义。血清miR-29a、miR-92a诊断结直肠癌各项诊断实验指标显著优于癌胚抗原(P<0.01),差异有统计学意义。结论血清miR-29a、miR-92a有望成为结直肠癌诊断及预后评估的生物标记物。

兰州地区人群的牙周健康状况和牙龈卟啉单胞菌感染情况分析

目的了解兰州地区人群的牙周健康状况,检测牙周健康者及牙周疾病患者口腔唾液中牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)的阳性率,为兰州地区人群防治牙周疾病提供科学依据。方法收集942例唾液标本,采用常规厌氧培养法,挑取产黑色素菌落进行革兰染色与生化鉴定。结果兰州地区人群牙周疾病患病率为78.45%,男女性别间差异无统计学意义(P=0.655);农村人群(53.45%)高于城市人群(46.55%),差异有统计学意义(P=0.029);各年龄段差异有显著的统计学意义(P=0.001),随年龄增长患病率呈增长趋势。兰州地区人群唾液中Pg总阳性率为71.23%,牙周疾病组(82.22%)显著高于牙周健康组(27.57%),差异有显著的统计学意义(P=0.000)。结论兰州地区人群牙周健康状况与生活环境、年龄、性别有关;在不同的牙周健康状况人群中牙龈卟啉单胞菌的分布不同。

施肥对当归熟地育苗生长及质量的影响

试验采用单因素随机区组设计,以磷酸二铵用量为试验因素,研究不同施肥量对熟地当归种苗生长及质量的影响,探究当归熟地育苗适宜的施肥量。结果表明:不同施肥量对当归种苗单根重、根粗及产量均影响显著;当磷酸二铵施肥量为300 kg/hm^(2)时,当归种苗单根重0.6 g,根粗3~4 mm,符合当归种苗标准及生产要求,而且当归种苗产量和一级苗所占比例均较高。300 kg/hm^(2)是当归熟地育苗过程中较为适宜的磷酸二铵施用量。

维生素B12检测方法研究进展

维生素B12作为一种生物活性物质,在贫血、神经系统疾病、出生缺陷、评价指标、营养强化等方面发挥重要的作用。由于维生素B12结构复杂,且含量很低,提升其检测手段具有重要的实际意义。该文对国内外维生素B12检测方法进行综述,主要包括液相色谱法,微生物方法,酶联免疫吸附测定法,原子吸收光谱法,电感耦合等离子测定法,电化学传感器方法,表面离子共振检测,荧光分子探针方法等,涉及光谱学、电化学、免疫学、色谱和微生物等学科。重点对维生素B12检测方法从技术原理、操作特点、分析效果以及应用范围作简单述评,最后对维生素B12检测技术手段的发展趋势进行讨论和展望。

胍丁胺与糖脂代谢

糖脂代谢异常及其所诱发的各种疾病的患病率逐年上升,已成为当今威胁人类健康的常见问题。寻找更为有效的预防和治疗与糖脂代谢异常相关疾病的方法已成为一个亟待解决的问题。胍丁胺(agmatine)是一种广泛存在于哺乳动物体内的多胺类物质,是L-精氨酸在精氨酸脱羧酶作用下脱羧基后的代谢产物,因此也被称为脱羧精氨酸。目前已发现其具有多种生物学作用。既往研究认为胍丁胺在糖尿病鼠中具有抗糖尿病的作用,不但可以缓解胰岛素抵抗,而且可以刺激胰岛β细胞分泌胰岛素,从而降低血糖。胍丁胺也可通过调节脂质代谢和脂肪酸的氧化等在脂代谢异常及其相关疾病中发挥积极作用。

hMASP2 DNA纳米脂质体对BCG感染小鼠肺组织T细胞亚群和AKT/pAKT蛋白表达的影响

目的:构建hMASP2 DNA纳米脂质体复合物,探讨hMASP2 DNA纳米脂质体对BCG感染小鼠肺组织T细胞亚群和AKT/pAKT蛋白表达的影响.方法:构建pcDNA3.1-hMASP2重组表达质粒,以脂质体作为载体,制备质粒DNA纳米脂质体复合物并检测Zeta电位和粒径;经鼻滴入1×10~9CFU BCG 100μL,建立结核分枝杆菌感染小鼠模型,实验分DNA纳米脂质体组(pcDNA3.1-hMASP2组)和对照组,在感染当天小鼠尾静脉分别注射pcDNA3.1-hMASP2 200μL(25μg DNA)和PBS 200μL,每3天注射一次,连续治疗三周后处死小鼠;分离肺组织淋巴细胞,流式细胞仪检测T细胞亚群;肺组织免疫组化分析AKT、pAKT蛋白表达.结果:pcDNA3.1-hMASP2 DNA纳米脂质体复合物Zeta电位52.6 m V、平均粒径279.9 nm;与对照组相比,pcDNA3.1-hMASP2组小鼠肺组织CD4^+T细胞亚群百分比明显升高(P<0.05)、CD4^+PD-1^+T细胞亚群百分比降低(P<0.05);pcDNA3.1-hMASP2组小鼠肺组织AKT和pAKT的阳性细胞百分比明显增高(P<0.05).结论:构建稳定的pcDNA3.1-hMASP2 DNA纳米脂质体复合物,pcDNA3.1-hMASP2纳米脂质体增加BCG感染小鼠的肺组织的CD4^+T细胞、促进肺组织pAKT蛋白的表达,降低肺组织的PD-1^+T细胞亚群,从而上调小鼠T细胞功能.

蜡样芽胞杆菌显色培养基在饲料检测中的应用研究

为探讨蜡样芽胞杆菌显色培养基在饲料微生物检测中的应用,利用普通培养基和蜡样芽胞杆菌显色培养基,对60份饲料样品中蜡样芽胞杆菌进行分离培养,疑似阳性的菌落提取基因组DNA,利用PCR扩增蜡样芽胞杆菌gyr B基因进行测序验证。结果表明,普通培养基和显色培养基检出的阳性样品分别为13例(21.7%)和10例(16.7%)。通过gyr B基因测序验证普通培养基和显色培养基检测方法的假阳性率分别为76.9%和70.0%。蜡样芽胞杆菌显色培养基用于饲料中蜡样芽胞杆菌的检测,能够有效抑制其他杂菌的生长,降低普通培养基检测的假阳性率,适用于饲料中蜡样芽胞杆菌的检测。

大肠杆菌O157显色培养基在饲料检测中的应用研究

为探讨大肠杆菌O157显色培养基在饲料微生物检测中的应用价值,试验利用免疫磁珠法和大肠杆菌O157显色培养基对60份饲料样品进行大肠杆菌O157分离鉴定,对疑似阳性的菌落提取基因组DNA,利用PCR扩增蜡样芽胞杆菌ofb基因进行测序验证。结果表明,饲料样本经过免疫磁珠法筛选后,亚碲酸钾山梨醇麦康凯(CT-SMAC)琼脂检出阳性的样本数为13例(21.67%);大肠杆菌O157显色培养基阳性样本为8例(13.33%);通过ofb基因测序验证CT-SMAC琼脂和显色培养基方法检测假阳性率分别为84.60%和75.00%。大肠杆菌O157显色培养基用于饲料中大肠杆菌O157的检测,能够有效抑制其他杂菌的生长,降低普通培养基检测的假阳性率,适合于饲料中大肠杆菌O157的检测。

显色培养基在饲料沙门氏菌检测中的应用

研究旨在探讨沙门氏菌显色培养基在饲料微生物检测中的应用。利用氯化镁-孔雀绿增菌液和亚硒酸盐胱氨酸培养液增菌后,利用沙门氏菌显色培养基对60份饲料样品中的沙门氏菌进行检测。传统检测方法确定,饲料中沙门氏菌阳性份数为2(3.3%),氯化镁-孔雀绿增菌-沙门氏菌显色培养基和亚硒酸盐胱氨酸培养液-沙门氏菌显色培养基检测的阳性率与传统方法相当。经过PCR扩增阳性样品的fim Y基因测序鉴定,两例阳性样品均为沙门氏菌。沙门氏菌显色培养基用于饲料中沙门氏菌的检测,具有菌落形态典型、易于分辨的特点,适用于饲料中沙门氏菌的检测。