动物细胞永生化研究进展

细胞永生化是指通过各种手段、方式来突破原代细胞衰老的限制,延长细胞寿命,实现细胞无限复制增殖,是当前生物医学领域研究的一个热点与难点。永生化细胞株/系可用于生物制品研发、衰老机制探索以延伸生命等;然而目前永生化细胞种类不多、永生化技术相对较难,肿瘤风险以及动物福利伦理等原因,还不能满足研发需求。目的细胞永生化不仅可以永久保存动物细胞遗传资源,还对多种疾病的诊断、治疗及细胞基质疫苗的研发等提供支持。本文就动物细胞永生化的原理、永生化机制及方法的研究最新进展进行综述,为未来的生物医学研究和应用提供参考。

MDCK细胞无血清悬浮培养技术在流感疫苗研究与生产中的应用进展

流感是一种常见的呼吸道疾病,由流感病毒引起,接种疫苗是预防流感的有效手段。MDCK细胞(Madin-Darby Canine Kidney Cells)具有易于培养和高产量的特点,可以支持流感病毒的复制和增殖,被广泛用于流感疫苗的研究和生产。随着对流感病毒研究的不断深入,为了进一步拓展MDCK细胞用于流感病毒研究和工业应用的能力,研究人员开始发展MDCK细胞无血清全悬浮培养技术。通过长期的培养和优化,驯化的MDCK悬浮细胞株可以更好地适应流感病毒的生长环境,提高流感病毒的产量和感染性。总之,MDCK细胞无血清悬浮培养技术在流感病毒研究和工业应用中发挥着重要作用,为流感疫苗生产和抗流感药物研发提供更好的工具。同时也必须重视MDCK细胞的安全性,采取合适的措施来确保其应用的安全性和可靠性。

动物细胞生物反应器研究进展

细胞基质生物制品大规模生产工艺的选择首要考虑因素是该产品工艺所涉及的生物反应器系统。论文针对动物细胞培养的基本特点,就不同动物细胞生物反应器的结构和原理、优点与缺点、结构优化、传感器最新进展等进行了综述,其目的在于为生物制品研发和生产实际应用中选择更加适合培养工艺的生物反应器,提高动物细胞大规模培养生产生物制品的效率,也为促进新型生物反应器的研究与开发提供一定的参考。

动物细胞低氧培养相关调控因子研究进展

近年来低氧细胞培养逐渐成为研究热点,低氧条件下可提高细胞体外扩增的生长动力学、细胞的增殖率及干细胞分化等功能。缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是应答低氧应激的关键因子,也是介导低氧信号的转导中枢,与其相关的血管内皮生长因(vascular endothelia growthfactor,VEGF)、低氧促有丝分裂因子(hypoxia-induced mitogenic factor,HIMF)及促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)等是其重要的靶基因,它们之间的相互作用对低氧条件下细胞的发生、发展有重要作用。笔者对低氧培养细胞的研究现状及低氧相关细胞因子的调控机制及作用进行概述,以期为探索细胞低氧机理提供理论依据,为低氧适应性及高原疾病治疗提供更多的研究思路。

动物细胞培养用片状载体特性分析

目的探讨不同片状载体的表面特性及对不同细胞的培养效果。方法选择3种片状载体(A、B、C),对其材料进行化学元素组成分析,对经0.1 mol/L NaOH溶液预处理前后的载体进行接触角检测。通过测定Vero、MDCK和MRC-5细胞在3种载体上的贴附效果和葡萄糖消耗量,并利用荧光染色法观察细胞生长状态,比较3种载体的细胞贴附率和培养效果。结果3种载体均主要由C、H、O 3种元素组成,且含有少量的N和S元素。预处理前,载体B的接触角为0°,显著低于载体A[(109±3.13)°]和C[(121±6.82)°](F均为709.1,P均<0.0001),亲水性较强,载体A和C亲水性较差;预处理后,3种载体表面的接触角均为0°,差异无统计学意义(F=0.0694,P>0.05),均亲水。培养3 h内,3种载体的细胞贴附率均在80%以上,细胞在载体纤维上均致密,长势均匀,葡萄糖消耗量曲线均趋于“S”型,细胞连续培养效果良好。葡萄糖消耗总量载体A与C基本一致,载体B低于A和C。结论对3种片状载体的化学元素组成和亲疏水特性关系进行了分析,并对Vero、MDCK和MRC-53种细胞的贴附率及培养效果进行了评价,为片状载体的后续研究及生产应用提供了参考。

虚拟仿真实验技术在动物生理学实验教学中的应用探索

随着网络信息技术的快速发展,虚拟仿真实验技术逐渐应用于普通高校实验教学中。本文以动物生理学实验教学为研究对象,论述了传统动物生理学实验教学的弊端,结合虚拟仿真技术探索动物生理学的实验教学。实践表明,虚拟仿真实验技术与动物生理学实验教学的融合,可以有效地提升学生的分析和实践能力,激发学生的学习兴趣,推动传统教学模式向信息化、智能化方向的变革。

丹参素异丙酯对肝细胞脂肪过度蓄积的改善作用及其机制

目的探索丹参素异丙酯[isopropyl3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoate,IDHP]能否通过改善线粒体功能来抑制肝细胞的脂肪蓄积,减轻非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)患者的脂肪过度蓄积症状。方法利用游离脂肪酸棕榈酸和油酸(PA∶OA摩尔比=1∶2)诱导肝细胞脂肪蓄积,模拟细胞脂肪化模型。首先,利用CCK-8检测不同浓度PAOA及IDHP对细胞活力的影响;选用600μmol·L^(-1) PAOA诱导4株肝细胞脂滴蓄积,通过检测尼罗红(Nile Red)荧光信号和甘油三脂(triglycerides,TG)、胆固醇(TC)含量来判定细胞脂肪化模型建立是否成功;分别检测经不同浓度IDHP干预后,细胞内活性氧(ROS)含量、还原型谷胱甘肽(GSH)活性、三磷酸腺苷(ATP)水平及线粒体膜电位(MMP)的变化。结果PAOA诱导后,细胞内出现大量脂滴蓄积,TG、TC含量升高,生成过量的ROS,同时GSH活性降低,ATP合成减少且线粒体膜电位下降。而随着IDHP干预浓度的增加,能有效改善脂滴蓄积,抑制TG的累积,减少活性氧的生成,提高GSH的活性,ATP生成量增加,且线粒体膜电位恢复至正常水平。结论IDHP可通过发挥抗氧化作用缓解氧化应激,改善线粒体功能,调节能量代谢,进而抑制肝细胞脂肪变性。

低氧下牦牛、黑白花牛肾间质成纤维细胞PDK1、Smad2、Caspase3等因子表达差异研究

为了比较低氧条件下不同海拔牛种肾间质成纤维细胞(RIFs)内PDK1、Smad2、Caspase3等因子的表达差异及细胞增殖差异,并进一步探究牦牛肾脏的高原低氧适应性特点,本研究采用牦牛和黑白花牛RIFs作为研究对象,低氧(1%O2)处理后,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(WB)法检测细胞内PDK1等因子表达差异。波形蛋白(Vimentin)免疫组化染色鉴定结果显示,两种牛的原代RIFs纯度较高,可用于后续试验。低氧处理后,两种牛的RIFs内PDK1、Smad2及Caspase3的mRNA和蛋白表达均存在不同程度上调,且种属间存在显著差异(P<0.05),牦牛HIF-1α、PDK1、Smad2及Caspase3等基因表达量于24 h达到峰值,之后下调,而黑白花牛基因则随时间呈递增趋势,且牦牛RIFs低氧下增殖能力低于黑白花牛。综上所述,低氧诱导的相关转录因子表达存在差异,两种牛RIFs的增殖能力存在差异,这可能是导致低氧下黑白花牛肾纤维化程度的加深,从而产生肾源性高原疾病的原因之一。本研究为比较不同海拔牛种肾脏的低氧适应性研究提供了基础数据,为探索牦牛肾脏高原低氧适应机制提供了一定的理论依据。

基于RNA-Seq技术的MDCK细胞成瘤性关键基因的验证

MDCK细胞(Madin-Daby Canine Kidney Cells)由于其病毒感染效率高、增殖快,且不易变异等特点,适用于流感疫苗的生产,但是其对免疫缺陷小鼠具有很高的成瘤性,一直以来,探究无成瘤的MDCK细胞株成为科研人员的研究重点。本研究通过试验筛选出与成瘤相关的12个基因,运用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR),获得这些基因在高成瘤MDCK-W73,低成瘤MDCK-C35和MDCK-C09细胞株中的相对表达量。结果表明,提取的RNA纯度高,完整性好。各基因在不同成瘤性细胞中的表达具有差异性,且qRT-PCR与RNA-Seq的差异性表达相一致。由此说明,RNA-Seq测序结果真实可靠,为后续的试验奠定了良好的基础。

动物血清的成分及在细胞培养中的作用

动物血清是一种常见的细胞培养基添加剂,通常需要添加一定浓度血清用于原代细胞和连续传代细胞(单层)培养的附着和生长。血清中所含的激素、蛋白酶抑制物质、矿物质、白蛋白等物质可对细胞产生积极影响,但同时也存在不同批次血清成分不恒定,质量不好把控的风险,而且,不同细胞的血清添加浓度、使用同源或异源血清也会对细胞培养效果产生影响。本文就动物培养用血清的成分、浓度以及种类对于细胞培养的影响做了讨论,并探究了其作为细胞培养添加剂的不足。

低氧对牦牛肺动脉平滑肌细胞增殖及氧化应激损伤作用的影响

【目的】通过研究低氧环境对牦牛(Bos grunniens)肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)增殖及氧化应激损伤的影响,初步探究牦牛肺动脉平滑肌对低氧的适应性特点。【方法】分离纯化并利用α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)鉴定牦牛PASMCs。试验分为常氧组和低氧组,采用CCK-8法检测牦牛PASMCs在低氧和常氧状态下0、2、4、6、12、24、48、72、96、120 h的增殖效率;采用ELISA法检测常氧组和低氧组培养24、48、72、96 h细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的蛋白浓度。【结果】细胞鉴定结果表明,95%以上的细胞均能表达α-SMA,即分离纯化所得细胞为牦牛PASMCs。CCK-8结果表明,低氧组在72、96、120 h细胞增殖倍数极显著低于常氧组(P<0.01);低氧组和常氧组在72 h的细胞增殖倍数均极显著高于48 h(P<0.01),表明牦牛PASMCs在72 h出现增殖高峰,且长时间的低氧环境能够降低牦牛PASMCs增殖效率。ELISA检测结果表明,与常氧组相比,低氧组牦牛PASMCs培养上清液中LDH蛋白浓度在72 h极显著上调(P<0.01);SOD蛋白浓度在72、96 h均极显著或显著上调(P<0.01;P<0.05);CK蛋白浓度在48、72 h均显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01);MDA蛋白浓度在72 h显著上调、96 h显著下调(P<0.05)。在低氧条件下,各时间点上清液中LDH、SOD蛋白浓度差异不显著(P>0.05),CK、MDA蛋白浓度在24、48和72 h均显著高于96 h(P<0.05)。在常氧条件下,上清液中LDH蛋白浓度在48 h显著高于24、72 h(P<0.05);SOD蛋白浓度在24、48 h均显著高于72、96 h(P<0.05);CK蛋白浓度在24 h显著高于72、96 h(P<0.05);MDA蛋白浓度在48 h显著高于72 h(P<0.05)。【结论】长时间低氧能够增强牦牛PASMCs氧化应激反应和细胞损伤,抗氧化作用减弱,细胞增殖效率显著降低,LDH、SOD、CK和MDA 4种蛋白在低氧条件下牦牛PASMCs损伤与抗损伤以及抗氧化中发挥重要调节作用,这可能与牦牛肺脏血管的低氧适应性有关。

人胚肺细胞系(MU-L1)生物学特性研究

目的:对新建人胚肺细胞系(MU-L1)的生物学特性进行评价,以期建立可用于疫苗生产的人二倍体细胞株.方法:使用不同培养基及血清、不同血清浓度和传代比例培养MU-L1细胞,通过细胞形态、增殖速率和生长动力学等进行比较分析,筛选出较适宜的培养条件,用适宜的培养条件连续培养细胞至生命周期结束.传代过程中检查无菌、支原体和外源病毒因子,并进行染色体核型分析.结果:在常用培养基(MEM、DMEM、M199、DME/F12和PRMI1640)、胎牛血清和新生牛血清中MU-L1细胞均良好生长;按1∶4传代比例,使用含10%新生牛血清的MEM培养基培养,可培养至67代(世代),在生命周期的不同阶段经液氮冻存,复苏活率在91.56%~98.92%,生长良好.染色体核型为正常人二倍体核型,2n=46,无菌、支原体和外源病毒因子检查均为阴性.结论:MU-L1为正常人二倍体细胞系,具备作为病毒性疫苗基质进一步研究和生产应用的价值.

不同批次新生牛血清对MDCK细胞培养效果的研究

为筛选适宜MDCK细胞生长的最佳血清,分析6个批次新生牛血清在两种培养方式即贴壁静置培养条件下MDCK细胞的生长状态、平均集落形成率及微载体悬浮培养条件下MDCK细胞的生长状态、生长速率、生长动力学情况。结果表明6组新生牛血清贴壁静置培养的MDCK细胞,平均集落形成率最大的为第Ⅴ组,最小的为第Ⅰ组,由大到小依次为第Ⅴ、Ⅵ、Ⅲ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅰ组;微载体悬浮培养条件下的MDCK细胞,最大增殖密度从大到小依次为第Ⅳ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅴ、Ⅱ、Ⅰ组,平均倍增时间由大到小依次为第Ⅵ、Ⅴ、Ⅲ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅰ组。因此,通过对不同批次血清贴壁静置培养的MDCK细胞生长状态、平均集落形成率及微载体悬浮培养的MDCK细胞生长状态、生长动力学评价,筛选出适宜细胞生长的新生牛血清批次为第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组,而第Ⅰ组新生牛血清对细胞生长的促进效果不明显,细胞生长状态不佳。

基于流感疫苗生产用MDCK细胞的安全性评价

随着流感疫苗产业升级,传统的鸡胚基质疫苗已经满足不了大众需求,世界卫生组织建议使用细胞来代替鸡胚生产流感疫苗,MDCK细胞被认为是最适合于流感疫苗生产的细胞系之一,但由于MDCK细胞会使免疫缺陷型小鼠形成肿瘤,因此其安全性存在争议。本文阐述了MDCK细胞的安全性问题及生产中的应对策略,旨在为细胞基质流感疫苗的生产提供理论基础。

生物反应器培养BHK-21悬浮细胞增殖伪狂犬病病毒工艺优化

旨在筛选伪狂犬病病毒(PRV)敏感的BHK-21细胞并分析其生长和病毒增殖特性,优化反应器中BHK-21悬浮细胞的培养和病毒增殖条件,建立生物反应器培养BHK-21悬浮细胞增殖PRV工艺。本研究利用响应面和单因素优化法,以细胞生长动力学特性、TCID_(50)病毒滴度等参数为指标,优化1.2 L生物反应器中BHK-21悬浮细胞的最佳培养和增殖病毒条件,在5 L生物反应器中进一步批培养验证。结果显示,筛选获得PRV高敏感的BHK-21-02贴壁细胞和BHK-21-XF02悬浮细胞各1株,BHK-21-XF02悬浮细胞在含3%血清的SLM-BHK低血清培养基和SFM-BHK无血清培养基中均能实现良好的生长和病毒增殖。利用响应面法优化得到1.2 L反应器最佳培养条件为接种密度1.20×10~6cells·mL^(-1)、搅拌转速120 r·min^(-1)、DO值40%,5 L反应器批培养72 h细胞密度可达(7.61±0.18)×10~6 cells·mL^(-1)、细胞活率为(96.93±1.18)%。利用单因素法优化得到1.2 L反应器最佳病毒增殖条件为MOI 0.001、培养温度37℃、细胞密度2.0×10~6cells·mL^(-1)、搅拌转速80 r·min^(-1),5 L反应器批培养接毒后48 h病毒滴度达到最大值(7.13±0.11)lgTCID_(50)·mL^(-1)。本研究可为PRV疫苗相关研究和规模化生产提供参考。

呼吸道病毒在感染过程中对温度的敏感性

由于呼吸系统结构特殊,导致呼吸道病毒在进入过程中会经历不同的温度。呼吸道病毒对不同温度环境中的呼吸道组织细胞的感染和复制动力学会产生改变。具有不同温度嗜性的呼吸道病毒有其独特的遗传进化特点。此外,某些呼吸道病毒温度敏感的特性会降低其在呼吸系统中的大规模扩散。然而,不同温度环境中的组织细胞所产生的抗病毒免疫反应也表现出一定的差异性,这给病毒利用“低温”组织细胞作为其藏匿处提供了新途径。本文将系统介绍温度对呼吸道病毒复制动力学、子代病毒稳定性、感染性和机体固有免疫等的影响,为深入探究病毒利用温敏这一生理学特点如何促进自身更好地适应宿主机体提供参考信息。

病毒类基因工程疫苗研究进展

疫苗接种被认为是控制病原体和预防人类以及动物疾病最有效的方法之一.近年来由于病毒性疾病来势汹汹,传统疫苗如灭活或减毒活疫苗的局限性及潜在问题日益突显,而基因工程技术的进步使得疫苗设计和研发得以改进,由此衍生的病毒类基因工程疫苗作为下一代疫苗越来越受到研究者的高度关注.通过病毒类基因工程疫苗的类型,重点介绍不同疫苗的开发原理、特点及用途,探讨其应用前景和发展趋势,旨在为新发病毒类疾病疫苗的研发提供参考.

流式细胞术优化MDCK细胞基因转染效率的研究

为探究脂质体介导的MDCK细胞基因转染效率,并获得最佳的优化方案,本研究选取不同配比的质粒和脂质体浓度,将p-EGFP-C1质粒转入MDCK细胞.转染后36 h,利用台盼蓝染色法检测细胞活率,流式细胞术检测细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达情况和转染效率,获得优化的转染条件.结果发现,转染后MDCK细胞,实验组细胞活力与阴性对照组差异不显著(P>0.05).当质粒(μg)∶脂质体(μL)浓度配比为0.5∶1.0、0.5∶1.25、0.5∶1.5时,转染率达到了较高水平,分别为(23.4±3.4)%、(24.5±4.5)%、(25.2±3.7)%,从经济因素考虑,脂质体介导的MDCK细胞基因转染质粒(μg)与脂质体(μL)的最佳配比浓度为0.5∶1.0.这为MDCK细胞用于基因转染提供了一定的理论基础.

动物细胞培养基质片状载体的研究及应用进展

以聚酯纤维为基质的片状载体具有良好的耐酸碱性、耐热性、生物相容性以及不可生物降解、促进细胞黏附和生长等优点。片状载体无动物源性成分,生物安全性高,是细胞培养基质的首选载体之一。近年来,随着生物技术的发展,广泛应用于细胞基质生物制品等研发及生产中。本文对片状载体的结构和细胞培养特点以及在疫苗生产、细胞治疗和组织工程等中的应用作一综述,为片状载体技术后续的进一步研发和应用提供理论依据。

新疆叶城沙蜥生境适宜性评价及生境廊道模型构建

保护或创造破碎化生境中的景观连通性被认为是保护生物多样性、生态系统以及促进野生动植物种群的流动和适应气候变化的关键战略,而生境廊道是恢复和保护景观连通性的常用策略。以塔里木盆地为例,结合该区域内叶城沙蜥(Phrynocephalus axillaris)21个栖息地分布点数据,运用MaxEnt模型对该区域叶城沙蜥的生境适宜性进行分析,并综合植被类型、地理因素、人为干扰等因素,利用Linkage Mapper工具构建适宜叶城沙蜥扩散的潜在生境廊道。结果表明:对叶城沙蜥潜在适宜分布区影响较大的环境因子包括最冷季度平均气温、最冷月份最低气温、植被覆盖类型、最冷季度降水量、坡度及最干月份降水量。在所记录到的21个叶城沙蜥分布点中,6个属于最佳栖息地,6个属于适宜栖息地,另外9个属低适宜栖息地。以MaxEnt模型分析的叶城沙蜥适宜区分布情况为基础,共构建32条生境廊道,包括11条长距离廊道和21条短距离廊道。其中短距离廊道连通邻近栖息地,长距离廊道连通南北栖息地。研究结果有助于优化叶城沙蜥栖息地格局,同时为塔里木盆地区域周边及部分吐鲁番盆地爬行类物种持续发展提供科学参考,并为荒漠生态系统的物种保护与保护区规划提供借鉴思路。