马铃薯ACS基因克隆及生物信息学分析

1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxlic acid synthetase,ACS)是乙烯合成途径中的限速酶,为明确其基因结构为目标,根据已报道的基因序列信息,用马铃薯栽培品种‘甘农薯2号’试管苗作为材料,提取叶片总RNA,设计基因特异性引物,利用RT-PCR克隆出ACS基因,并对基因及其蛋白进行了生物信息学分析.结果表明:ACS基因CDS区长1 461bp,编码486个氨基酸,ACS蛋白分子量约为55kU,PI 6.76;具有12个alpha螺旋区域,22个beta片层区,32个转角和23个自由卷曲区;具有39个疏水区和41个亲水区;同源性分析表明ACS基因在高等植物中保守性较高.

马铃薯块茎休眠解除过程的形态学观察与鉴定

利用石蜡切片分析了室温储存条件下马铃薯栽培品种‘Favorita’块茎休眠解除过程中的形态组织学变化,并对块茎中的淀粉和蛋白质含量的变化作了研究。结果显示,马铃薯块茎在休眠期芽眼分生组织细胞停止分裂,伴随着休眠的解除,芽眼分生组织细胞开始分裂且分裂速度越来越快,芽原基最终形成一个完整的芽,伴随此过程,观察到芽原基周围部分细胞程序性死亡最终发育形成环纹、螺纹导管的现象;马铃薯块茎从休眠解除到芽的萌发过程中淀粉含量则出现下降且淀粉颗粒逐渐由规则卵圆形变为较小的不规则状,在靠近芽原基的分化部位蛋白质含量有明显上升趋势。室温储存60 d的块茎被认为完全解除休眠。

马铃薯乙烯响应因子基因的克隆表达及生物信息学分析

根据番茄ERF5基因(NM_001247583.1)序列设计引物,采用RT-PCR方法得到马铃薯ERF基因的cDNA,并对其进行生物信息学及表达分析.结果表明:该cDNA全长789bp,阅读框为732bp,编码243个氨基酸.序列同源性分析表明该基因序列与番茄ERF5基因的序列同源性达82%,氨基酸序列同源性达70%.对该马铃薯ERF基因的氨基酸序列经BLAST进行多序列比对,发现该氨基酸序列的98～160bp为AP2结构域,属于AP2/EREBP转录因子的EREBP亚族ERF类.蛋白质三级结构预测表明该基因的AP2结构域非常保守.对ERF基因进行荧光定量PCR分析,表明该基因可能参与了马铃薯块茎解除休眠与发芽过程的调控.

干旱胁迫下马铃薯差异表达基因的验证分析

为了深入了解马铃薯的抗旱机制,本研究选择Solexa高通量测序中log2(fold change)≥11倍的22个差异基因,包括6个转录因子、4个脯氨酸代谢、4个抗氧化防御系统、4个类黄酮生物合成和4个植物激素信号转导相关基因,采用qRT-PCR检测20%PEG6000处理0、1、6、12h后马铃薯叶片中22个基因表达的变化.结果表明:被检测的22个基因的结果与Solexa高通量测序的结果一致,并且在不同干旱处理时间下各基因表达各不相同,表现出5种表达模式:上调-上调-上调、下调-下调-下调、上调-下调-上调、上调-下调-下调、上调-上调-下调.马铃薯对不同时间点的干旱可能采取不同的应对策略,对1h和6h干旱可能是减少不必要的能量和物质消耗,12h干旱胁迫下才调动大量抗逆相关物质,抵抗干旱的伤害.

马铃薯HD-Zip Ⅰ家族ATHB12基因的克隆及功能鉴定

HD-Zip I是一类植物特异转录因子,在植物应对外界逆境胁迫过程中有重要的调控作用。本研究从马铃薯栽培品种甘农薯2号中克隆了HD-Zip I转录因子ATHB12基因,其开放阅读框为759 bp,编码252个氨基酸残基。该基因位于马铃薯第1染色体,其启动子区含有ABRE、LTRECOREATCOR15和WBOXATNPR1等多种响应非生物胁迫(ABA、低温、脱水和高盐)的顺式作用元件。ATHB12基因在马铃薯根、茎和叶中均有表达,其根中表达量最高。q RT-PCR分析证实该基因的表达受聚乙二醇(PEG)、Na Cl和ABA诱导,受低温抑制。构建了由组成型表达启动子Ca MV 35S驱动的ATHB12基因的过表达载体,通过农杆菌介导法转化马铃薯获得了转基因植株。干旱处理后,转基因植株叶片中丙二醛含量显著低于非转基因植株(P<0.05),而脯氨酸含量显著高于非转基因植株(P<0.05);转基因植株根鲜重和干重均高于非转基因植株;说明马铃薯ATHB12基因可能参与了逆境胁迫的响应。

amiRNA技术沉默C-3氧化酶编码基因StCPD对马铃薯抗旱性的影响

CPD(constitutive photomorphogenesis and dwarf)基因编码C-3氧化酶,为油菜素内酯(brassinosteroid,BR)生物合成途径中的限速酶,在植物响应逆境胁迫过程中具重要调控作用。本研究利用人工micro RNA(artificial micro RNA,ami RNA)技术,构建马铃薯CPD基因(StCPD)的干扰表达载体p CPB121-ami Rcpd,通过根癌农杆菌介导法将其转入马铃薯栽培品种"紫花白",获得转基因植株(Ci1~Ci5),其中Ci1和Ci3的StCPD基因干扰程度分别为78%和90%。基因组织表达特异性分析表明,StCPD在马铃薯试管苗叶片中表达量最高,是茎和根中表达量的3.05倍和1.65倍。转基因植株株高、茎粗、根长、鲜重及薯的大小和鲜重等指标均较非转基因(NT)植株显著下降,表明StCPD基因干扰表达后,植株的长势明显受到抑制。模拟干旱胁迫处理下,转基因植株叶片中丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量显著高于NT植株,而脯氨酸含量显著低于NT植株。转基因和NT马铃薯中,StCPD基因的表达量、MDA和脯氨酸含量均显著高于对照;且随着胁迫处理时间延长,基因表达量呈持续增强趋势,MDA和脯氨酸含量随之增加。结果表明,StCPD基因干扰表达能明显降低马铃薯对干旱胁迫的抵抗能力,为进一步研究BR对马铃薯生长发育和对干旱胁迫的响应奠定了基础。

CryⅢA基因植物表达载体构建及马铃薯遗传转化

利用In-Fusion技术将酶切位点不匹配、目的基因内部含载体酶切位点的CryⅢA基因和植物表达载体pBI121相连接,分别成功构建了组成型启动子CaMV 35S和马铃薯茎叶特异表达启动子ST-LS1驱动的CryⅢA基因植物表达载体。利用冻融法将2个重组质粒转入根癌农杆菌LBA4404,转化马铃薯栽培品种陇薯3号和甘农薯2号获得了转化植株,经卡那霉素筛选和PCR检测,共有10株阳性植株CryⅢA基因成功整合到马铃薯基因组中。经实时荧光定量PCR检测表明,CryⅢA基因在CaMV 35S驱动的CryⅢA转基因植株的根、茎、叶中均有表达,且在叶中表达量较高,茎和根次之;在马铃薯茎叶特异表达启动子ST-LS1驱动的CryⅢA转基因植株中,在根中未见表达,仅在茎、叶中表达,且在叶中表达量较高。

可溶性淀粉合成酶SSⅢ基因对马铃薯的遗传转化

马铃薯是淀粉生产中重要的农作物之一,而可溶性淀粉合成酶SSⅢ是可溶性淀粉合成酶的主要活性成分,通过基因工程的手段来研究SSⅢ基因在淀粉合成中的功能可以用于改良马铃薯淀粉的品质。本研究采用根癌农杆菌介导法将强组成型表达启动子CaMV35S驱动的可溶性淀粉合成酶SSⅢ基因的RNA干扰表达载体导入马铃薯栽培品种克新1号和克新4号中,获得了65株卡那霉素抗性植株。对抗性植株PCR检测结果表明,SSⅢ基因的干扰片段已整合到马铃薯基因组中,RT-PCR检测表明SSⅢ基因在转录水平上受到了明显抑制。该研究为马铃薯淀粉品质的改良奠定了基础。

ARF基因干扰表达对不同发育阶段和贮藏条件马铃薯酶活性的影响

以前期研究获得的马铃薯栽培品种＂甘农薯2号＂ADP核糖基化因子（ARF）基因干扰表达转化植株为材料,用qRT-PCR法对转基因植株的ARF基因表达量进行了测定,结果表明,不同发育阶段转基因叶片中ARF基因的相对表达量先降低,生长后期略有增加,表明ARF基因干扰表达量随马铃薯生长发育发生改变。ARF基因干扰表达影响马铃薯叶片中酶活性,不同发育阶段转基因叶片与对照相比,多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）活性升高11.61%-27.84%,硝酸还原酶（nitrate reductase,NR）活性提高21.10%-41.32%,磷脂酶D（phospholipase D,PLD）活性降低2.88%-57.64%,蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase,SPS）活性提高29.00%-39.57%;不同温度（4℃和室温）贮藏的块茎中ARF基因的相对表达量变化趋势一致：均先降低,再升高,但前者较后者ARF基因相对表达量显著降低。室温较4℃贮藏的转基因块茎PPO活性升高30.44%-56.28%,NR活性提高17.41%-40.92%,PLD活性降低24.39%-85.11%,SPS活性提高30.89%-45.78%。室温较4℃贮藏的非转基因块茎PPO活性升高25.11%-70.66%,NR活性提高36.07%-89.62%,PLD活性降低11.35%-72.64%,SPS活性提高27.31%-61.33%。本研究通过探讨ARF基因干扰表达对马铃薯生理生化特性的影响,为进一步研究ARF基因在马铃薯生长发育调控中的作用提供一定的理论基础。

转PPase基因对马铃薯块茎休眠特性的影响

利用农杆菌介导法将组成型表达启动子CaMV35S驱动的正义和反义无机焦磷酸酶（PPase）基因导入到马铃薯栽培品种‘费乌瑞它’的试管薯中，通过PCR检测证明PPnse基因已转入马铃薯基因组中．对转基因株系及对照植株块茎的休眠特性的测定表明，分别在4℃低温和25℃室温贮藏条件下的转反义基因马铃薯株系块茎的休眠期较对照株系均延长了2～3周；转正义基因马铃薯株系块茎的休眠期较对照株系均提前了2～3周；且在4℃低温贮藏条件下的转基因马铃薯株系及对照块茎的休眠期比25℃条件贮藏的长2～3周，为进一步利用PPase基因改良马铃薯块茎休眠特性提供科学依据．

转正义和反义PPase基因对马铃薯块茎休眠相关生理指标的影响

将转正、反义无机焦磷酸酶(PPase)基因马铃薯‘甘农薯2号’块茎分别贮藏于4℃和25℃下90 d,测定其PPase活性和无机Pi含量等生理生化指标。结果表明,在25℃贮藏温度下,与未转基因对照相比,转正义PPas e基因的两个株系(G-2-4和G-2-5)块茎中PPase活性、Pi与可溶性糖含量均增加,与未转基因对照相比差异显著,G-2-4的淀粉含量与未转基因对照相比显著降低。转反义PPas e基因的两个株系(G-1-1和G-1-2)PPase活性、Pi与可溶性糖含量均降低,与未转基因对照相比差异显著,G-1-2淀粉含量与未转基因对照相比极显著增加。与25℃贮藏温度相比,4℃贮藏温度下转正、反义基因株系块茎中的PPase活性、Pi、可溶性糖和淀粉含量的变化趋势与25℃贮藏温度基本一致,但其PPase活性、Pi含量和淀粉含量高于25℃贮藏温度下的转基因株系块茎,而其可溶性糖含量低于25℃贮藏温度下的转基因株系块茎含量。

马铃薯抗青枯病育种研究进展

由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的青枯病是危害马铃薯产业的重要病害,抗病品种的选育与推广是防控马铃薯青枯病最高效、经济的手段。国内外研究人员通过多种方法对马铃薯种质资源进行了青枯病抗性鉴定,结果表明马铃薯四倍体栽培种中缺乏青枯病抗源,但在马铃薯野生种中存在丰富的抗性种质资源。通过远缘杂交、体细胞融合、转基因以及诱变等技术创制了一批抗青枯病资源,为马铃薯新品种选育奠定了良好的基础。针对马铃薯抗青枯病资源缺乏的瓶颈,未来的研究重点应集中在筛选抗青枯病种质资源和通过多种途径创制抗青枯病材料,为马铃薯抗青枯病品种选育奠定基础。同时建立马铃薯青枯病分子标记辅助育种体系,提高抗青枯病品种选育的效率。

马铃薯ARF基因RNAi载体的遗传转化及对其试管薯生理特性的影响

用含有ADP核糖基化因子（ARF）基因的干扰载体的农杆菌转化马铃薯栽培品种＂甘农薯2号＂,获得转化植株48株,经卡那霉素抗性筛选和PCR检测证明ARF基因已成功整合到马铃薯基因组中。用实时荧光定量PCR检测表明,转化植株中ARF基因的表达较对照均有不同程度的下降,在转基因株系Z-11和Z-12中,ARF基因表达的干扰程度分别高达92.53%和93.22%。对转基因植株诱导的试管薯的淀粉、可溶性糖、蛋白质、蔗糖和葡萄糖含量测定结果表明,与未转基因的对照相比,转基因植株的淀粉含量提高了4.29%~34.27%,蛋白质含量提高了1.47%~7.35%,可溶性糖含量提高了1.44%~17.39%;蔗糖含量提高了11.53%~53.84%,而葡萄糖含量降低了6.06%~21.21%。

马铃薯响应磷胁迫机制及磷高效利用育种

无机磷是马铃薯生长和块茎发育必需的大量营养元素,广泛参与了遗传物质和生物膜的构成、能量转化以及代谢调控等过程,对马铃薯茎叶生长和块茎发育起着重要的作用。土壤的磷含量会明显影响马铃薯的发育,且在不同遗传特性的马铃薯品种间存在磷效率差异。为了保证马铃薯的正常生长和产量的稳定,磷肥在马铃薯种植业中被大量使用。然而,磷肥的过量使用已对环境和人体健康造成了一定威胁,随着中国对环境和食品安全标准的不断提高,有效解决这一问题已迫在眉睫。因此,充分利用马铃薯自身遗传特性来提高无机磷的利用率,是保持块茎产量、节约种植成本和降低环境影响的有效方法。综述了国内外对马铃薯磷酸盐转运机制和响应磷胁迫生长的相关研究,以期为深入研究马铃薯无机磷转运机制和培育磷高效利用品种提供科学的指导策略。

马铃薯StCDPKs基因家族成员鉴定与表达分析

【目的】通过对马铃薯StCDPKs基因家族成员的鉴定与表达模式分析,初步阐明该基因家族在马铃薯胁迫响应中的功能.【方法】用隐马尔科夫模型鉴定马铃薯StCDPKs基因家族成员,MEGA6.0构建StCDPKs蛋白序列的系统进化树,qRT-PCR分析StCDPKs基因在组织特异性和盐胁迫下的表达情况.【结果】本研究共鉴定出27个马铃薯StCDPKs基因家族成员,它们均包含CDPKs蛋白钙离子结合域最保守的结构域EF-hand;其中StCDPK2/421/22/25基因在马铃薯不同组织中表达差异显著,StCDPK8/10/11/18/22基因在盐胁迫下表达量明显升高.【结论】共鉴定获得27个马铃薯StCDPKs基因家族成员,其中StCDPK8/10/11/18/22基因与马铃薯响应盐胁迫相关,研究结果可为进一步阐明马铃薯StCDPKs基因的功能提供基础.

马铃薯StMAPK4响应低温胁迫的功能解析

马铃薯易受低温危害,造成减产。MAPK基因广泛参与多种环境胁迫,研究发现其参与低温调控。为探究马铃薯StMAPK4在响应低温胁迫过程中的功能,本研究以马铃薯栽培品种‘Atlantic’为试验材料,分析其在低温(4℃)胁迫下不同时间点在马铃薯根茎叶中的表达特性,并对StMAPK4基因进行生物信息学分析及对其编码的蛋白进行亚细胞定位分析,构建StMAPK4的过表达和RNAi干扰表达载体,转化马铃薯获得转基因植株,并分析了在4℃处理下非转基因(NT)、过表达和RNAi干扰表达转基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性、脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量的变化。结果显示,StMAPK4蛋白的等电点为4.97,属于酸性蛋白,该蛋白定位于细胞核和细胞膜;低温胁迫下,StMAPK4在根茎叶中的表达量显著升高;StMAPK4过表达植株的SOD、POD活性和脯氨酸含量较NT植株明显升高,而MDA含量明显降低;StMAPK4干扰表达植株的SOD、POD活性和脯氨酸含量较NT植株明显降低,而MDA含量明显升高;通过表型观察发现,非转基因和RNAi干扰表达植株的叶片萎蔫严重,而过表达植株的叶片受影响较小。因此,过表达StMAPK4基因可以增强马铃薯植株对低温胁迫的耐受性。

马铃薯品种和组织对基因组测序深度分布模式的影响

【目的】探讨品种和组织对马铃薯基因组测序深度分布的影响.【方法】对‘布尔班克’和‘云薯107’2个品种的薯块芽端和茎端进行了深测序,建立了在参照基因组上的测序深度分布图.【结果】发现这些分布在品种间有明显差别(例如在三号染色体中部和尾部),在同一品种的DNA样本间很类似,但芽端和茎端在二号染色体有明显差别.这些结果说明测序深度的分布主要受品种基因组本身所影响,也受薯块上部位影响,而且在很大程度上可以重复.【结论】这些结果能帮助设计试验和合适利用测序深度.

小麦TaGSK5基因的克隆与表达分析

【目的】糖原合成激酶(glycogen synthase kinase,GSK)在响应植物非生物胁迫和参与植物生长发育调控方面起重要作用.克隆小麦GSK基因家族成员,分析其序列结构和表达模式,为进一步解析小麦GSK基因功能提供理论依据.【方法】通过同源克隆从小麦品种陇中1号中获得TaGSK5的4个同源基因cDNA序列,利用生物信息学结合qRT-PCR方法对TaGSK5进行基因序列和蛋白结构预测,以及基因表达模式分析.【结果】小麦TaGSK54个部分同源基因分别位于小麦1A、4A、5B和5D染色体上,分别命名为TaGSK5-1A,TaGSK5-4A,TaGSK5-5B和TaGSK5-5D.本研究克隆该基因的cDNA全长为1281 bp,包含12个外显子和11个内含子,编码426个氨基酸,具有激酶结构域,其蛋白结构与粗山羊草亲缘关系较近.TaGSK5编码的蛋白为可溶性蛋白,等电点分别为8.53、8.57、8.79和8.54,分子量分别为48226.51、47602.69、48237.52和48314.58.二级结构元件以α-螺旋和不规则卷曲为主.TaGSK5基因在小麦根、茎、叶和穗中均有表达,但在穗中表达量较高;该基因在干旱胁迫处理后0~6 h表达下调,在盐胁迫下表达量没有显著变化.【结论】小麦TaGSK5包含4个同源基因,位于不同的染色体上,其编码氨基酸序列高度相似,该基因可能负调控小麦耐旱性,与盐胁迫无关.

15个马铃薯AP2/ERF转录因子的生物信息学与表达分析

AP2/ERF(APETALA2/ethylene-responsive factor)是植物中的一大类转录因子,其参与非生物胁迫反应、激素应答、植物生长、花发育、种子发育、损伤响应、病菌防御、耐高盐等多种生物学过程,为了初步阐明该转录因子在马铃薯胁迫响应中的功能,本研究对15个马铃薯StERF基因进行了生物信息学和表达分析。结果表明,15个马铃薯StERFs转录因子除St ERF3、StERF10、St ERF12、StERF120仅具有WLG结构域外,其余11个均具有YRG和WLG结构域,在进化上可分为3个亚家族(AP2,ERF和RAV)。对15个StERFs基因上游2000 bp启动子区的顺式作用元件分析发现,其包含ABRE、CGTCA-motif、TGACG-motif和TCAelement等响应元件。RT-qPCR分析结果表明马铃薯StERFs基因在聚乙二醇(PEG-6000)、乙烯、水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和甘露醇等处理下表达模式不同,StERF79、StERF72在5种处理下均上调表达,StERF156,StERF5在水杨酸和甘露醇胁迫处理下均上调表达。结果为进一步研究马铃薯StERFs基因的功能提供了基础。

马铃薯脱落酸受体StPYR1基因生物信息学分析及过表达载体构建

以马铃薯基因数据库中基因ID为PGSC0003DMT400005378 (落酸受体PYR1基因)的核苷酸序列作为原始序列,用在线比对软件NCBI进行Blast比对其在拟南芥、番茄、烟草等物种中同源序列,以同源性为100%的核苷酸序列(GenBank accession No. XM_006361126.2)进行生物信息学分析,并作为模板序列设计引物,以马铃薯栽培品种‘陇薯3号’无菌试管薯为实验材料,用RT-PCR的方法获得StPYR1基因的cDNA序列,构建了其过表达载体pCPB-StPYR1,取得的结果可为研究StPYR1基因在马铃薯块茎休眠调控中的作用提供基础。