白菜型冬油菜质外体抗冻蛋白研究

为探明冬油菜抗寒机理,采用大田试验和盆栽试验,对低温胁迫的白菜型冬油菜品种‘陇油6号’叶片和根的质外体蛋白进行抗冻活性检测,通过SDS-PAGE分离质外体蛋白并结合MALDI-TOF/TOF质谱技术对部分高表达蛋白进行了鉴定。结果表明,‘陇油6号’经人工气候室冷驯化后,叶片质外体蛋白质含量显著增加(P<0.05),在第5 d达92.31μg?g?1(FW),比对照增加246.12%。质外体蛋白含量在冷驯化第10 d和第15 d与第5 d相比虽有所降低,但仍显著高于对照(P<0.05)。在冷驯化第20 d和第25 d质外体蛋白含量继续显著增加,第25 d达到最高值(P<0.05)。室温恢复生长10 d后,质外体蛋白含量比之前显著下降(P<0.05),但仍高于对照和冷驯化第10 d。在冷驯化过程中,‘陇油6号’叶片的质外体中出现明显的蛋白质积累,室温恢复生长10 d后,质外体中的蛋白质含量显著降低,可见冷驯化的‘陇油6号’质外体蛋白属低温诱导蛋白。抗冻活性检测发现其具有重结晶抑制活性。质谱鉴定发现多种功能尚不明确的蛋白质,其中β^(-1)-3-葡聚糖酶与冬黑麦中报道的抗冻蛋白一致。对质谱检测到的类葡聚糖酶回收及抗冻活性测试发现其有较弱的冰晶形态修饰作用,表明这个类葡聚糖酶是一种低活性抗冻蛋白。低温胁迫下冬油菜叶片和根质外体中合成分泌了抗冻蛋白,在抵御外界低温中起到积极作用,同时推测超强抗寒性冬油菜质外体中可能存在多种未被发现的抗冻蛋白。

白菜型冬油菜‘陇油7号’叶片响应低温胁迫的差异蛋白鉴定与分析

为了从蛋白质组学的角度探讨超强抗寒品种白菜型冬油菜‘陇油7号’的抗寒机理,本研究采用TCA(三氯乙酸)-丙酮沉淀法,提取低温胁迫(4℃,7 d)前后的叶片总蛋白,对蛋白提取方法、IPG(固定pH梯度)胶条种类等环节进行了优化,运用双向电泳和质谱分析技术,鉴定了低温胁迫下‘陇油7号’5叶期叶片总蛋白质组分的表达差异模式。结果表明:改进后的蛋白质提取液(含DTT,二硫苏糖醇)和PVPP(聚乙烯吡咯烷酮)得到的蛋白质平均浓度较改进前高3.42μg·μL-1,除盐时间较改进前短1.14 h;同时,含蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)的蛋白提取液获得的蛋白质种类丰富,凝胶图谱中可检测到661个蛋白点,较改进前可测蛋白点数(587)提高11.2。采用17 cm p H 4~7的IPG胶条的电泳能更好地分离蛋白,得到重复性好、分辨率高的蛋白质组图谱。利用PDQuest 8.0软件分析比较了超强抗寒品种‘陇油7号’低温胁迫前后的蛋白组表达谱,发现低温胁迫前后共有15个质变的蛋白质点,推测这些差异蛋白点可能与低温胁迫的响应有关。进一步对质变的蛋白质点进行了质谱分析,鉴定出11个与低温胁迫相关的蛋白质点,这些蛋白包括光合作用相关的蛋白、糖代谢相关的蛋白、物质运输相关的蛋白和逆境响应相关的蛋白。而且,低温胁迫处理前后,‘陇油7号’叶片蛋白质的表达水平存在明显差异,这些差异蛋白可能在冬油菜抗寒响应中发挥重要作用。