人外周血白细胞雄激素受体基因表达的研究

目的 :研究雄激素受体 (AR)基因在正常人外周血白细胞中的表达。方法 :采用 RT- PCR和 Northern印迹方法检测健康成年人外周血白细胞 AR m RNA的表达。结果 :用 RT- PCR方法得到了 390 bp的 AR c DNA片段 ;用 Northern印迹方法检测出长约 9.4kb的 AR m RNA,与文献报道的人前列腺组织 AR m RNA大小相同。结论 :两种方法均证实了 AR在人外周血白细胞中的表达 ;该结果为研究雄激素影响白细胞功能的机制及探讨病理情况下

肾小球系膜细胞转化生长因子-β_1基因启动子中氧化低密度脂蛋白应答元件的研究

目的 :了解在氧化低密度脂蛋白 (Ox LDL)刺激下 ,转化生长因子 β1(TGF β1)基因启动子中顺式作用元件的应答情况。研究在大鼠肾系膜细胞中 ,Ox LDL对TGF β1基因启动子转录活性的影响作用。 方法 :用聚合酶链反应 (PCR)、酶切和亚克隆的方法 ,构建出 5个TGF β1启动子缺失体—虫荧光素酶 (luciferase)报告基因 ,利用其瞬时转染系膜细胞并检测luciferase相对活性。 结果 :在Ox LDL(10 0mg/L)刺激下 ,luciferase的活性 12h即出现 ,并于 36h达到平台期。对Ox LDL刺激的应答 ,TGF β1启动子 15 5 0到 845之间可能存在着增强子 , 6 2 9到 4 2 2之间则可能有抑制子。计算机软件分析表明 ,前者内有一转录激活蛋白 1(AP 1)精确识别位点。 结论 :在大鼠肾系膜细胞TGF β1基因启动子中 ,AP 1结合序列 (TGAGTCA)可能是应答Ox LDL的顺式作用元件。Ox LDL上调TGF β1的表达至少部分是通过AP 1蛋白来介导的 ,且Ox LDL可能通过蛋白激酶C(PKC)信号通路激活AP 1从而正调控TGF β1基因的转录过程。

急性B淋巴细胞白血病B细胞B7分子表达缺陷

目的 探讨B7分子表达与急性B淋巴细胞白血病 (BALL)发病机制的的关系。方法 Ficoll Hypaque密度梯度离心法分离出患者及正常人的外周血单个核细胞 ,体外培养 2 4h后 ,流式细胞仪检测B细胞细胞膜表达B7.1、B7.2表达的百分率 ;BALL组与正常对照组作组间比较。结果 与正常对照组相比 ,BALL组B7.1、B7.2表达及B7.1、B7.2双表达的百分率明显低于正常人 (P <0 .0 5 )。结论 BALL外周血B细胞B7分子的表达存在缺陷 ,可能是BALL的发病机制之一及白血病细胞逃避机体“免疫监视”的重要原因。

细胞内DNA和RNA显色反应的改进

利用经典的细胞生物学染色方法显示细胞内DNA与RNA,在实际教学过程中出现与理论上有较大的偏差,经对染色方法进行改进并进行了多次比较实验,获得了较为理想的结果,该实验结果将为医学细胞生物学实验课教学提供一个良好的方法。加深学生对细胞内DNA与RNA分布的理解。

弥漫性甲状腺肿伴甲状腺功能亢进患者外周血白细胞雄激素受体基因表达的探讨

弥漫性甲状腺肿伴甲状腺功能亢进（Graves病）为病因不明的自身免疫性疾病，女性与男性发病之比约为5：1，提示Graves病与性激素有一定联系。雄激素对免疫系统有重要的调节作用。本研究采用放射配体结合法及逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）等方法检测Graves病患者外周血白细胞雄激素受体（AR）蛋白结合活性及mRNA表达，探讨其在Graves病的作用机制及意义。

全反式维甲酸和Caspase抑制剂Z-VAD-FMK对胰腺癌细胞凋亡的作用

目的 观察全反式维甲酸 (ATRA)对体外胰腺癌细胞生长的影响以及 caspase抑制剂 Z-VAD- FMK对细胞凋亡的作用。方法 胰腺癌细胞 Pa Tu8988与 ATRA或与 ATRA+ caspase抑制剂Z- VAD- FMK共同孵育后 ,用 MTT方法观察细胞活性 ,观察细胞超微结构改变 ,DNA断裂分析 ,流式细胞仪检测凋亡细胞比例和测定 caspase- 3活性。结果 ATRA对细胞的生长有明显的抑制作用。 A-TRA诱导后电镜和 DNA断裂分析发现典型凋亡特征。与 ATRA处理组相比 ,ATRA和 Z- VAD- FMK联合作用对细胞凋亡比例无影响。ATRA组 caspase- 3蛋白的活性随孵育时间延长而升高 ,且与凋亡比例相关 ,Z- VAD- FMK处理组 caspase- 3活性明显下降。结论 ATRA能够抑制胰腺癌细胞生长并诱导细胞凋亡。同时 ,与 Z- VAD- FMK联合作用能抑制 caspase蛋白活性 ,但未使细胞凋亡比例相应降低 ,提示在胰腺癌凋亡过程中可能有其他蛋白酶的作用。

慢性髓性白血病细胞来源的树突状细胞大容量诱导及其功能的实验研究

目的 探索大容量诱导慢性髓性白血病 (CML)细胞来源的树突状细胞 (DCs)的适宜方法 ;研究CML DCs刺激自体T淋巴细胞增殖并分泌γ 干扰素 (IFN γ)的能力。方法 用CS 30 0 0 plus血细胞分离机采集初诊CML病人的外周血单个核细胞 (PBMNCs) ;单采的CML PBMNCS转入组织培养袋 ,加入重组人粒 巨细胞集落刺激因子 (rhGM CSF)和重组人白介素 4 (rhIL 4 ) ,培养诱导 7d ;在诱导前后 ,用流式细胞仪分别检测细胞表面HLA DR、CD1a、CD80和CD86的表达水平 ;用3 H TdR掺入法检测CML DCs和CML PBMNCs刺激自体和异体T细胞增殖的能力 ;用ELISA法检测在自体混合淋巴细胞培养 (MLR)时T细胞分泌的IFN γ浓度。结果 用血细胞分离机收集的CML PBMNCs ,在组织培养袋内经细胞因子培养诱导 ,HLA DR、CD1a、CD80、CD86的表达均有明显上调 ,细胞形态也表现典型的DC特征 ;CML DCs能显著刺激自体和异体T细胞增殖 ,而CML PBM NCs仅能刺激异体T细胞的增殖 ,刺激自体T细胞增殖的能力很弱 ;刺激自体T细胞增殖时分泌的IFN γ浓度 ,CML DCs组为 (877± 2 14 )pg/mL ;CML BPMNCs组仅为 (14± 1.7) pg/mL。 结论 单采的CML PBMNCs转入组织培养袋 ,加入rhGM CSF和rhIL 4 ,可收获大容量的CML DCs;CML DCs在体外具有显著刺激自体T细胞增殖?

重组腺病毒载体携带凋亡素基因对肝癌细胞的作用

目的探讨带有AFP启动子的重组腺病毒载体介导凋亡素基因对肝癌细胞的作用。方法测定腺病毒AdAFPvp3滴度,并以MOI=100感染Hepa1-6肝癌细胞(AFP+),HEK293细胞(AFP-),Lewis肺癌细胞(AFP-),24h后Hoechst33258染色观察凋亡形态学改变,RT-PCR检测vp3基因的表达。腺病毒AdAFPvp3以MOI=100感染hepa1-6肝癌细胞,FCM检测肝癌细胞不同时段凋亡率。结果腺病毒AdAFPvp3滴度为5×109PFU/ml,Hoechst33528染色显示甲胎蛋白阳性的Hepa1-6肝癌细胞出现凋亡形态学改变,RT-PCR检测只有甲胎蛋白阳性的Hepa1-6肝癌细胞表达vp3mRNA。FCM表明凋亡素基因能有效诱导肝癌细胞凋亡。结论带有特异性甲胎蛋白启动子的重组腺病毒载体,介导凋亡素基因导入肝癌细胞后,对于能合成甲胎蛋白的肝癌细胞,具有特异性靶向性致凋亡作用。

动物性中药材地龙DNA条形码初步研究

利用通用引物对中药材地龙的COⅠ、16S rDNA片断进行PCR扩增、测序、分析,并构建系统进化树,将获得的中药材地龙COⅠ、16S rDNA片断序列提交到GenBank中的DNA Barcoding数据库进行分析。结果显示:(1)中药材地龙COⅠ片断的长度为682 bp,其中变异位点(SNP多态位点)有179个,多态位点约占片断总长的26%,碱基A+T的含量为58.8%、G+C的含量为41.2%。16S rDNA片断的长度为503 bp,其中变异位点有70个,多态位点约占片断总长的14%,碱基A+T的含量为62.4%、G+C的含量为37.6%;(2)获得COⅠ序列的登录号为HQ405769-HQ405776,16S rDNA序列的登录号为HQ405777-HQ405783;(3)中药材地龙DNA中COⅠ序列的基因多态性比16S rDNA序列更显著,适合做为中药材地龙的DNA条形码。

广西眼镜蛇蛇毒神经生长因子在大肠杆菌中的表达

目的采用基因工程技术,在大肠杆菌(E.coli)中表达广西眼镜蛇(黑眼镜蛇)蛇毒神经生长因子(NGF)成熟蛋白并检测其生物活性。方法将天然广西眼镜蛇蛇毒的NGF蛋白基因克隆至融合表达载体pET-40b(+)中,以C端融合了6个组氨酸的形式在E.coli BL21(DE3)通过异丙基硫代半乳糖苷诱导表达NGF蛋白。超声破菌后,将上清液经Ni^(2+)-NTA柱纯化,收集并冻干NGF融合蛋白,用蛋白印迹法分析其NGF抗原活性,并通过促PC12细胞生长法观察其生物活性。结果经蛋白印迹分析可知在38 ku处的条带具有NGF抗原活性。加入天然蛇毒NGF,生长轴突的PC12细胞为(83±3)%,重组品为(21±3)%,表明经纯化的融合蛋白具有NGF生物活力,但活性弱于天然蛇毒NGF。结论在大肠杆菌中可以表达出有活性的蛇毒NGF蛋白。

建立我国中药材DNA条形码数据库方法的探讨和前景展望

中药鉴定是中药学的核心。我国的中药材种类繁多,资源丰富,由于来源复杂,真伪难辨,传统的中药鉴定技术有各种不足。近些年出现的DNA条形码可以很好地应用于中药材的鉴定。建立一个中药材的DNA条形码数据库对我国中药材鉴定是非常有益的,可以极大地提高中药材的鉴定水平,促进中药的现代化。DNA条形码在动物中采用线粒体基因已经确定,但是植物中还没有广泛认同的条形码标准片段。由于中药材绝大多数是植物,目前植物类中药材条形码的研究倾向于用一种或多种条形码联合应用。

丝裂霉素C与表达Smac/DIABLO的肿瘤靶向腺相关病毒联用对抗恶性黑色素瘤的效果

目的探讨重组腺相关病毒(rAAV)介导促凋亡因子Smac/DIABLO是否能提高恶性黑色素瘤细胞对丝裂霉素(MMC)的敏感性。方法将携有目的基因的rAAV加入到培养液中转染肿瘤细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(EGFP)的表达,RT-PCR检测Smac/DIABLO基因的表达,MTT法测定肿瘤细胞增殖,流式细胞术测定肿瘤细胞的凋亡;动物在体实验测定抗肿瘤效果。结果 rAAV转染96h后几乎所有细胞表达明亮的黄绿色荧光。RT-PCR检测发现转染48h后目的基因Smac/DIABLO稳定表达。MTT检测显示rAAV-hTERT/Smac/DIABLO+MMC对肿瘤细胞的抑制率最高(P<0.05)。流式细胞检测结果显示,rAAV-hTERT/Smac/DIABLO+MMC组肿瘤细胞的凋亡率明显高于生理盐水(HBSS)组、MMC组和rAAV-hTERT/Smac/DIABLO组(P<0.01)。动物实验结果表明,rAAV-hTERT/Smac/DIABLO+MMC有非常强的抑制肿瘤作用,其抗癌效果优于HBSS、MMC、rAAV-hTERT/EGFP和rAAV-hTERT/Smac/DIABL组。结论 rAAV-hTERT/Smac/DIABLO在体内、体外均能提高肿瘤细胞对MMC的敏感性。此作用与Smac/DIABLO的促凋亡作用有关。

侧柏籽核糖体失活蛋白的分离及作用机制研究

提出了从裸子植物侧柏中分离纯化核糖体失活蛋白的制备和检测方法.通过盐溶液抽提、硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析、阳离子交换层析等步骤制备了该蛋白.该蛋白的检测方法是把这种蛋白作用于大鼠 80S肝核糖体后, 不经过酸性苯胺处理,直接进行聚丙烯酰胺的尿素变性胶电泳.在电泳图上得到 400 bp左右的特征性核酸条带.分析结果表明,该蛋白为一种新的核糖酶型的核糖体失活蛋白,阐明了侧柏核糖体失活蛋白失活核糖体的分子机制.

全反式维甲酸对胰腺癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用

目的建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型,通过体内实验观察全反式维甲酸(ATRA)对胰腺癌的治疗作用。方法将人胰腺癌细胞株SW 1990和Bx-PC3细胞接种于裸鼠皮下,建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型,予ATRA 40 mg/kg每日口服,或4 mmol/LATRA每次0.1 mL隔日瘤内注射。观察瘤体质量和体积变化,TUNEL法观察ATRA干预后移植瘤组织内的细胞凋亡情况,免疫组化法检测caspase-3的表达。结果成功建立两种人胰腺癌细胞株的移植瘤模型;口服和瘤内注射ATRA后,抑瘤率在Bx-PC3移植瘤分别为64.24%和55.78%,在SW 1990移植瘤分别为44.03%和49.13%;TUNEL法和电镜观察证实,ATRA诱导后移植瘤内出现细胞凋亡;免疫组化显示,caspase-3表达增加。结论ATRA口服或瘤内注射均能抑制胰腺癌移植瘤的生长,活化胰腺癌细胞内caspase-3,促进细胞凋亡。

3种药用红树植物rDNA ITS序列初步研究

应用改良CTAB法分别提取生长于珠海和海南的3种药用红树植物秋茄、老鼠簕和桐花树的基因组DNA,以真核生物rDNA ITS区的通用引物分别对其rDNA ITS区进行nPCR扩增及测序,并对测序结果进行对位排列。结果表明,不同来源的药用红树植物的rDNA ITS序列上存在扩增碱基差异,rDNA ITS测序结果可作为鉴定药用红树植物种质资源的分子标记之一。

杂合突变的PCR产物中包含异源双链DNA片段的研究

目的:验证杂合突变的PCR产物中包含异源双链DNA片段。方法:采用PCR、PAGE电泳和变性高效液相色谱分析的方法,对中国人表皮松解性掌跖角化症致病基因KRT9第1外显子的杂合的碱基插入/缺失突变(497delAinsGGCT)进行实验验证。结果:KRT9基因第1外显子碱基插入/缺失突变(497delAinsGGCT)杂合子的PCR产物,本身包含2种异源双链DNA片段和2种同源双链DNA片段,不需要经过额外的变性、退火处理。结论:在用DGGE、TGGE、DHPLC和HA等需要形成杂合双链体的基因突变检测技术进行突变检测时,如果突变为杂合子,则PCR产物可以直接进行突变检测,不需要预先加热/冷却等预处理以形成异源双链DNA分子。

ABC-ELISA检测尿Ⅳ型胶原方法的建立及其对早期糖尿病肾病的诊断价值

目的 建立一种新的检测尿Ⅳ型胶原 (ⅣC)的ABC ELISA系统 ,评价尿ⅣC对早期糖尿病肾病 (DN)的特异性诊断价值。方法 应用制备的抗ⅣC抗体成功地建立了ABC ELISA ,该系统能直接从尿液中检测到ⅣC。在临床试验中 ,对 12 0例 2型糖尿病 (DM )病人及多组对照同时进行 2 4h尿ⅣC(UCER)和白蛋白 (UAER)的测定。结果 在 0 .5～ 5 0 0ng/ml浓度范围内 ,建立尿ⅣC测定的标准曲线。在 1～ 12 5ng/ml之间 ,尿ⅣC浓度与A值呈显著正相关 (r =0 .84 ,P <0 .0 4 )。该ELISA系统的敏感性达 0 .5ng/ml,与其他蛋白质的交叉反应性 <1%。与正常对照组、原发性肾小球肾炎组、原发性高血压组及冠心病组相比 ,UCER在DM病人中显著升高 ,尤其是在UAER 2 0 0～ 30 0mg/ 2 4h亚组更加明显 (P <0 .0 1)。在DM病人中 ,UCER与Ccr呈显著负相关(r=- 0 .4 1,P <0 .0 0 1)。结论 我们成功地建立了直接检测尿ⅣC的ABC ELISA系统并发现 。