乳腺癌前病变组织原代成纤维细胞生物学特征初步研究

目的比较乳腺导管不典型增生成纤维细胞(atypical intraductal hyperplasia fibroblasts,AFs)与正常乳腺成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs)、乳腺癌肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)在生物学特征上的差异。方法采用Ⅰ型胶原酶法分离并培养AFs、NFs和CAFs,免疫细胞荧光化学检测其粘连蛋白(fibronectin,FN)表达以鉴定细胞纯度。比较3种细胞的细胞生长曲线、细胞周期和周期蛋白cyclin D1、p21waf1及p53的变化。结果获得并鉴定了NFs、AFs、CAFs;其生长速度依次增加(P<0.05),细胞周期S期百分比(8.24±2.47)、(16.94±4.77)、(33.31±7.90)依次增大(P<0.05);与NFs相比,AFs周期蛋白cyclin D1表达增加(P<0.05),p21waf1和p53蛋白表达降低(P<0.05);与CAFs相比,AFs的周期蛋白cyclin D1没有升高(P<0.05),p21waf1蛋白和p53蛋白表达更强(P<0.05)。结论 AFs相对于NFs和CAFs,细胞生长增殖具有特异性,这种变化提示乳腺肿瘤的癌前病变阶段AFs可能是NFs逐步向CAFs转变的过渡阶段。

《普通生物学》课程中的兴趣教学方法探讨

《普通生物学》是临床医学七年制学生的一门基础课程。让学生学好这门课程,兴趣非常重要。后基因组时代生物医学展望演讲比赛,是一种形式活泼的兴趣教学方法,有利于学生开阔视野,了解生命科学前沿研究,培养查阅文献、归纳综合知识等多方面的能力。

医学细胞生物学教学思考与尝试

为提高教学质量,激发新生学习医学细胞生物学的积极性,在教学过程中结合基础课要求和新生特点,从精选学习内容、采用渐进性双语教学、逐步培养学生的求知兴趣、利用教学辅导帮助学生树立学习信心、增强其自学能力等多方面进行改革尝试。实践表明,这些措施克服了新生的畏难情绪,收到良好的教学效果。

医学细胞生物学实验教学改革的探索与实践

突出细胞生物学实验课教学的主体地位,实验课课程设置以验证性实验、综合性实验及创新性实验相结合,激发学生的积极性和主观能动性,培养学生的创新思维和分析问题解决问题的综合实践能力,取得了良好的教学效果。

科研思维培养在医学遗传学教学中的探索

针对医学遗传学的各个教学环节,应用引入科研思维新型教学法,促进学生融会贯通医学知识,了解医学前沿,培养学生独立创新能力,提高学生综合素质。

七年制医学遗传学网络教学的实践与探索

针对目前医学遗传学七年制教学的现状及七年制学生的特点,应用引入网络教学的新型辅助教学法,对七年制教学进行三方面的改革探索:建立了七年制医学遗传学网络互动平台,包含了教学材料、答疑讨论、课程问卷、试题库等数十个栏目,与学生形成良好互动;建立数字化显微互动实验室,利用新的形式在实验上提高学生动手能力;BBS创新实验互动教学平台的建立,为启发提高七年制学生科研能力提供了互动平台。

PCR及Real-time PCR评价细菌DNA提取方法

目的:比较几种不同的细菌DNA提取方法,建立一种适于PCR和Real-time PCR的细菌DNA提取方法。方法:分别用蛋白酶K法、碱裂解法、Chelex-100+NP40、Chelex-100+TritonX-100法和水煮法提取同种浓度大肠杆菌DNA,测定OD260/280;用不同方法提取不同浓度的大肠杆菌DNA,进行PCR和实时荧光定量PCR扩增,比较灵敏度。结果:5种方法提取细菌DNA,其中Chelex-100+NP40法纯度(OD260/280=1.79±0.03)最高,此方法所提取的DNA产物进行PCR及Real-time PCR扩增未见假阳性及假阴性,其灵敏度为10个/ml细菌浓度。结论:Chelex-100+NP40的细菌DNA提取方法纯度及灵敏度高,且适应于PCR及Real-time PCR。

人参皂苷Rg3诱导膀胱癌细胞系EJ的凋亡作用

目的:探讨Rg3抑制膀胱癌细胞的作用及其诱导凋亡的机制。方法:用一定质量浓度的Rg3处理膀胱癌细胞系EJ细胞,MTT法检测细胞增殖活力和抑制率50%的时候药物的浓度(IC50);Hoechst33258荧光染色观察凋亡细胞的形态;流式细胞仪分析细胞周期及细胞凋亡率;免疫细胞化学观察caspase-3的表达变化;琼脂糖凝胶电泳测定DNA梯状带。结果:Rg3抑制EJ细胞生长,呈浓度依赖关系,Rg3处理细胞48 h的IC50为125.5 mg.L-1;经150 mg.L-1Rg3处理细胞24 h和48 h后,观察到典型的凋亡细胞形态,即染色质凝集、核片段化、凋亡小体、核内致密的颗粒状荧光及caspase-3的表达增加;并呈时效依赖关系;用75 mg.L-1Rg3处理细胞24,48,150 mg.L-1的Rg3处理细胞48 h后,Rg3诱导了细胞凋亡和调节细胞周期,S期和G2/M期的细胞比率增加,G0/G1的细胞比率下降;凋亡率从对照组的(1.05±0.17)%分别上升到(8.41±0.98)%,(18.57±2.20)%和(33.98±1.64)%,琼脂糖凝胶电泳检测出典型的DNA梯形条带,其效应随药物浓度的增加和作用时间的延长而增强。结论:Rg3可通过诱导EJ细胞凋亡而发挥其抑制细胞增殖的作用。

云南省4种陆生贝类的营养成分分析

报道了云南省4种陆生贝类即褐云玛瑙螺(Achatina fulica)、金平坚螺(Camaena jinpingensis)、勐仑隐带螺(Cryptozona menglunensis)、勐仑环口螺(Cyclophorus menglunensis)的营养成分,并与猪肉、牛肉、鸡肉的营养成分进行比较。结果表明,这4种陆生贝类的蛋白质含量高,脂肪和糖类含量低,含有丰富的维生素和钙、磷、铁等无机元素,可作为优质保健食品进一步开发利用。

lncRNA-Gm4419对高糖培养的肾小球系膜细胞增殖和纤维化的影响

目的探讨长链非编码Gm4419对高糖培养的小鼠肾小球系膜细胞增殖和纤维化的影响。方法荧光定量PCR检测Gm4419在糖尿病肾病肾脏组织及高糖培养的肾小球系膜细胞中的表达水平。设计合成Gm4419 siRNA,同时构建pcDNA3.1(+)-Gm4419过表达质粒,并将Gm4419 siRNA和pcDNA3.1(+)-Gm4419过表达质粒分别转染至高低糖培养的肾小球系膜细胞,Ed U法检测转染后细胞的增殖能力;Western blot检测肾脏纤维标记蛋白的表达水平情况。结果 Gm4419在糖尿病肾病肾脏组织及高糖培养的肾小球系膜细胞中的表达水平较正常组及低糖组显著增高(P<0.01)。荧光定量PCR筛选出一条最佳干扰Gm4419的siRNA,转染高糖组后,与高糖mock组或对照组比较,高糖Gm4419 knockdown组细胞增殖能力减弱、纤维化标记蛋白表达减少(P<0.05)。此外,将酶切和测序结果证实构建成功的pcDNA3.1(+)-Gm4419过表达质粒转染至低糖组细胞,与低糖mock组或对照组相比,低糖Gm4419过表达组细胞增殖能力增强、纤维化标记蛋白表达水平增高(P<0.05)。结论lnc RNA-Gm4419参与糖尿病肾小球系膜增生和纤维化的调节。

内质网应激对ATF6调控XBP1启动子转录的影响

目的确定XBP1启动子的转录核心区域,探讨激活转录因子6(ATF6)在内质网应激(ERS)与非ERS状态下对XBP1启动子转录活性的调控作用。方法采用基因重组技术构建ATF6基因及两个缺失体ATF6s1p、ATF6s2p的真核表达载体pcDNA3.1(-)-ATF6、pcDNA3.1(-)-s1p、pcDNA3.1(-)-s2p,以及XBP1启动子报告基因载体pGL3-XBP1。针对XBP1启动子的各个组成元件设计和构建XBP1一系列截短体的报告基因载体。采用双荧光素酶报告基因法检测并确定XBP1启动子的核心启动子区,Western blotting检测ATF6及缺失体s2p、s1p在ERS与非ERS状态下对XBP1核心启动子区转录的调控作用。结果 XBP1启动子的-407bp-+133bp区域是转录活性调控的核心区域,-2000bp--407bp区域不具有转录活性,该区域可能含有抑制转录活性的组成元件。非ERS状态时,ATF6及两个缺失体s2p、s1p可明显上调XBP1启动子的转录活性及XBP1蛋白表达;而在ERS状态时,ATF6及两个缺失体s2p、s1p下调了XBP1启动子的转录活性和XBP1蛋白表达。结论 ATF6对XBP1的转录调控作用在ERS状态和非ERS状态下存在差异。非ERS状态时,ATF6上调XBP1的转录和表达,而ERS状态时,ATF6下调XBP1的转录和表达。

应用于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法

目的建立特异灵敏的适应于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法。方法于细菌样本离心所得沉淀中加入提取液(25%Chelex-100,0·5%NP40,TE配制,pH=9·0);56℃孵育30min;100℃水浴10min;离心后所得上清即为DNA。电泳、PCR及Real-time PCR扩增评价该方法的特异性及灵敏度。结果本方法所提细菌DNA电泳条带清晰,未见假阳性,D(260)/D(280)=(1·79±0·03);PCR及Real-time PCR扩增未见假阳性及假阴性,灵敏度达101/ml细菌浓度。结论本研究细菌DNA提取方法特异灵敏,适应于PCR及Real-time PCR。

miRNA-451表达质粒的构建及对人A549肺癌细胞侵袭转移及凋亡的影响

目的:探讨miRNA-451对人A549肺癌细胞侵袭转移及凋亡的影响。方法:Hsa-miRNA-451序列通过miRBase数据库查找,根据此序列设计出2条寡核苷酸片段,将目的基因经过退火处理后克隆至真核表达载体pGenesil-1.1质粒中,从而构建成为miRNA-451真核表达载体(pGenesil-1.1-miRNA-451质粒)。将pGenesil-1.1-miRNA-451及pGenesil-1.1-control质粒分别转染人A549肺癌细胞,经过G418的筛选,建立pGenesil-1.1-miRNA-451及pGenesil-1.1-control稳定表达的细胞株。流式细胞术分析检测细胞凋亡的情况;Transwell小室检测miRNA-451对细胞侵袭能力的影响;细胞划痕实验检测细胞的迁移情况。结果:经测序证实miRNA-451真核表达质粒构建成功,与未处理的人A549肺癌细胞和稳定表达pGenesil-1.1-control的细胞相比,稳定表达了pGenesil-1-miRNA-451的人A549肺癌细胞的侵袭和迁移能力均明显受到抑制影响,而细胞凋亡无明显变化(P>0.05)。结论:miRNA-451对人A549肺癌细胞侵袭转移具有显著的抑制作用,但对细胞凋亡作用不明显。

IRE1α重组腺病毒载体对ATDC5软骨干细胞增殖及凋亡的影响

目的构建重组人IRE1α腺病毒,观察其对软骨干细胞ATDC5增殖与凋亡的影响。方法应用pAdEasyTM腺病毒载体系统构建包含全长IRE1α基因和RNase+Kinase核心结构域的重组穿梭质粒pAdTrack-IRE1α、pAdTrack-R+K,通过电转法分别与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组,获得重组腺病毒pAd-IRE1α、pAd-R+K。随后在HEK-293细胞中包装并扩增重组腺病毒颗粒Ad-IRE1α、Ad-R+K。用直接PCR法鉴定重组腺病毒,后者体外感染软骨干细胞ATDC5,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)感染效率,并应用流式细胞仪分别检测在内质网应激(ERS)和非ERS状态时重组腺病毒对ATDC5细胞增殖和凋亡的影响。结果酶切鉴定和PCR证实成功构建了重组腺病毒质粒pAd-IRE1α、pAd-R+K。流式细胞仪检测结果显示,在ERS状态时,重组腺病毒质粒Ad-IRE1α、Ad-R+K感染后ATDC5细胞G1期比例明显降低,S期细胞比例明显升高(P<0.05),细胞凋亡率明显增高(P<0.05)。结论含IRE1α基因的重组腺病毒感染可促进ATDC5细胞的增殖和凋亡。

柚皮素通过抑制TGF-β1/smad信号传导通路缓解糖尿病肾病大鼠肾损伤

目的探讨柚皮素对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用及其对TGF-β1/smad信号传导通路的影响。方法将糖尿病肾病模型大鼠随机分为糖尿病肾病组和糖尿病肾病+柚皮素组,用药治疗6周。检测大鼠24 h尿蛋白定量、肌酐清除率和肾脏指数;HE染色观察肾组织形态和检测肾小球面积;实时荧光定量PCR检测Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白、TGF-β1、Smad2和Smad7 mRNA的表达;Western blot检测Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白、TGF-β1、smad7、总smad2和磷酸化smad2蛋白。结果糖尿病肾病组大鼠24 h尿蛋白(P<0.01)和肾脏指数(P<0.01)显著升高,肌酐清除率明显下降(P<0.01),肾小球明显肥大(P<0.05),Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白的mRNA水平和蛋白表达量均升高,TGF-β1和磷酸化smad2蛋白的表达量均升高,smad7蛋白表达量降低;经柚皮素50 mg/kg治疗后能明显降低糖尿病肾病大鼠的24 h尿蛋白(P<0.01)和肾脏指数(P<0.05),提高肌酐清除率(P<0.05),减轻肾小球肥大(P<0.05),Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白的mRNA水平和蛋白表达量降低,TGF-β1和磷酸化smad2蛋白的表达量均降低,smad7蛋白表达量升高。结论柚皮素可能通过调控糖尿病肾病肾组织TGF-β1/smad信号通路表达,减轻肾脏病理损害。

糖尿病肾病循环microRNA差异表达谱的分析

为了解循环microRNA在早期糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)发病机制中的作用,该文采用芯片筛查结合real-time PCR检测早期糖尿病肾病患者循环microRNA差异表达谱,同时应用生物信息学方法预测差异表达谱microRNA的靶基因.结果表明:芯片筛查出49个microRNA在DN中呈差异表达,其中信号值在两组中均大于1 000的microRNA有22个,17个上调,5个下调.选择其中差异倍数大于2的5个microRNA进行realtime PCR验证,结果与芯片结果一致,分别为let-7a,let-7d,let-7f和miR-363在DN中低表达,miR-4429在DN中高表达.同时,应用生物信息学技术预测了5个microRNA的靶基因,主要涉及细胞代谢过程调控、生长因子反应和细胞增殖等的相关基因.DN差异表达谱的建立为探寻microRNA发病中的作用以及DN的早期诊治提供了新的思路.

早期糖尿病肾病相关微小RNA在小鼠肾脏的表达变化

目的建立db/db小鼠早期糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)微小RNA(microRNA,miRNA)的差异表达谱。方法采用12只9周龄高血糖且24h尿白蛋白显著增高的db/db小鼠作为早期糖尿病肾病组,12只9周龄db/m小鼠作为正常对照组,用于miRNA芯片和实时荧光定量RT-PCR检测。Trizol法抽提肾脏总RNA,YM-100微离心滤器富集小RNA,芯片技术检测DN组和对照组miRNAs的差异表达谱。应用实时荧光定量RT-PCR验证部分差异miRNAs,运用生物信息学技术预测部分相关miRNAs的靶基因。结果芯片结果显示,66个miRNA在DN组和对照组存在差异表达(P<0.01),其中35个miRNAs在DN组呈高表达,31个miRNAs在DN组呈低表达,差异倍数从1.08～10.20。实时荧光定量RT-PCR进一步验证部分miRNA的表达,结果显示3个miRNAs在DN组表达上调,分别为:miR-196a、miR-98和miR-29c;4个表达在DN组下调,分别为miR-21、miR-451、miR-709和miR-187,差异显著(P<0.01)。结论部分miRNAs在DN和正常对照肾脏组织中存在差异表达,可能参与了DN发生的分子机制。

大一新生学习医学细胞生物学常见问题及解决办法

大学本科医学专业一年级新生在学习医学细胞生物学中常遇到各种问题,通过分析产生这些问题的原因,提出了若干解决办法.首先要帮助学生正确认识和对待从中学到大学的这一特殊过渡时期,建立科学的学习方法;其次,通过实施灵活多变的教学方法,激发学生的学习兴趣,培养他们的自主学习能力.经过实践,这些措施解决了多数新生的学习问题,取得了良好的效果.

外源性TGF-β1诱导人乳腺癌MCF-7细胞的乙醛脱氢酶1 mRNA及蛋白表达

目的本研究旨在探讨外源性TGF-β1诱导人乳腺癌MCF-7细胞对乙醛脱氢酶1(aldehyde dehydrogenase1,ALDH1)mRNA及蛋白表达的影响。方法用不同浓度(1、5ng/mL)的TGF-β1诱导体外培养的MCF-7细胞48h后,RT-PCR检测ALDH1mRNA的表达变化,Western blot检测ALDH1蛋白的表达变化。结果 TGF-β1(1、5ng/mL)诱导的MCF-7细胞的ALDH1mRNA及蛋白表达均高于未诱导的MCF-7亲本细胞,差异有统计学意义(P均<0.001);高浓度(5ng/mL)TGF-β1诱导的MCF-7细胞的ALDH1mRNA及蛋白表达均高于低浓度(1ng/mL)TGF-β1诱导的MCF-7细胞,差异有统计学意义(P均<0.001)。结论外源性TGF-β1可诱导人乳腺癌MCF-7细胞上调ALDH1mRNA及蛋白的表达,可能诱导ALDH1+乳腺癌肿瘤干细胞(cancer stemcell,CSC)的转化,并有一定的浓度依赖性。

小鼠睾丸发育全过程的组织学观察

为系统观察小鼠睾丸组织发育过程,将生后1～57d处于不同发育时期的17组昆明种正常小鼠睾丸组织制备石蜡切片、进行H.E染色分析。结果表明:小鼠生后初期睾丸曲细精管中只有支持细胞和原始生精细胞;至生后8d时出现B型精原细胞;15d时出现初级精母细胞;23d时出现次级精母细胞及少量圆形精子细胞,此后圆形精子细胞逐渐增多;30d时圆形精子细胞发生变态;36d时大量精子开始稳定出现于曲细精管管腔中,并延续至此后各期。这意味着小鼠生精细胞在出生后经过一个相对连续的发育分化过程,至生后约36d发育成熟。这为细化小鼠睾丸组织发育和精子发生过程提供了详细资料。