组织工程骨植骨临床应用七年随访结果

目的总结生物衍生组织工程骨植骨临床应用的中期效果。方法2000年12月-2001年6月,采用同种异体骨膜来源的成骨细胞1×106/mL与生物衍生骨支架材料构建组织工程骨,经体外培养3～7d后,植入修复10例骨缺损。男6例,女4例;年龄14～70岁,中位年龄42。其中骨囊性病变2例,陈旧性骨折不愈合1例,新鲜粉碎性骨折伴骨缺损6例,慢性化脓性骨髓炎1例。每例患者植入生物衍生组织工程骨量3～15g,平均7.3g。结果10例患者术后伤口均Ⅰ期愈合。术后获随访7年,除1例于术后1年发生植骨松动外露取出,以及1例并发创伤后肱骨头坏死取出外,其余植骨均在术后3.0～4.5个月达骨性愈合。X线片检查:除1例患者已行肱骨头切除术外,其余均达到骨愈合,骨皮质连续,重塑良好。患肢功能能满足日常生活及工作需要。结论生物衍生组织工程骨具有良好的成骨能力,临床应用中期效果良好,未见明显排斥反应及并发症。

IGF-1促原代人胚骨骼肌成肌细胞体外增殖与分化的研究

目的为更好地将成肌细胞应用于组织工程构建,探讨IGF-1对原代人胚骨骼肌成肌细胞体外增殖与分化的作用与机制。方法通过核素3H-TdR掺入法测定不同浓度IGF-1(1、2、4、8、16和32ng/mL)作用下成肌细胞的每分钟射线脉冲数(count per minute,CPM)值,根据浓度-CPM值量效曲线确定IGF-1促增殖的适宜浓度。在生长培养基中加入该浓度的IGF-1用于实验组细胞,对照组细胞仅接受生长培养基。分别观察实验组与对照组生长曲线,比较两组细胞增殖周期的变化。运用流式细胞技术及核素掺入法测定适宜浓度IGF-1作用下,成肌细胞增殖周期的变化。另选取不同浓度IGF-1(0、5、10、15、20、25、30ng/mL)作用于成肌细胞,观察4d后成肌细胞融合率,通过融合率-IGF-1浓度-量效曲线确定IGF-1促进成肌细胞融合的最佳浓度,并将其用于实验组,而未接受该浓度IGF-1的成肌细胞作为对照组,分别测定两组细胞融合率与磷酸肌酸激酶(creatine kinase,CK)含量并进行比较。结果5ng/mL的IGF-1为促成肌细胞增殖最佳浓度。对照组成肌细胞倍增时间为96h;实验组成肌细胞生长曲线左移,倍增时间缩短为60h。对照组DNA G1、S期与G2M期各亚周期所占时间分别是70.03、25.01与0.96h,实验组为22.66、16.47与20.87h。实验组与对照组成肌细胞CPM峰值出现的时间分别是48h与96h,与生长曲线流式细胞技术测定结果一致。IGF-1促进分化研究显示20ng/mL IGF-1为促成肌细胞分化最佳浓度。实验组成肌细胞融合率较对照组提高30%,CK合成量提高2000mU/mL。结论IGF-1对成肌细胞的增殖与分化均具有促进作用,是通过减少G1期成肌细胞数量,增加S期与G2M期细胞实现的。20ng/mL IGF-1能明显增加成肌细胞融合率CK合成。

BMSCs复合胶原材料三维诱导软骨细胞的初步研究

目的通过体外培养犬BMSCs,以胶原海绵作为支架材料,体外三维复合培养后,观察向软骨细胞定向诱导的可行性。方法健康家犬10只,体重10～15kg,雌雄不拘。抽取骨髓,体外培养BMSCs,传至第3代,倒置相差显微镜观察细胞形态。实验组将第3代BMSCs以1×106/mL密度接种于胶原海绵支架材料,体外培养48h后,将细胞材料复合物以软骨细胞定向诱导培养基进行诱导,每隔2天换液;对照组将第3代BMSCs以相同密度接种于胶原海绵支架材料,每隔2天以DMEM换液。培养后14d,将细胞材料复合物行HE染色和免疫组织化学染色观察。结果倒置相差显微镜下第3代BMSCs与第2代BMSCs形态基本一致,传代初期细胞伸出伪足,呈梭形或三角形,7d后逐渐以梭形为主,胞体饱满,细胞传代后增长速度明显加快。组织学观察:实验组细胞广泛分布于支架材料孔隙内,多数细胞呈多角形或者不规则形,少数呈短梭形,细胞周围间隙可见基质成分;对照组细胞分布于支架材料孔隙内,呈梭形或圆形,核呈圆形或椭圆形,胞体较大,胞质透亮均匀,细胞核轮廓清楚,呈蓝色。免疫组织化学染色显示,实验组支架材料孔隙内的细胞胞浆可见棕黄色颗粒,细胞周围出现黄染区;对照组无表达。结论BMSCs接种于胶原海绵材料后,经定向软骨诱导后,可向软骨组织方向分化。

成肌分化因子和5-氮杂胞苷体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向骨骼肌细胞的分化(英文)

背景:传统治疗肌组织缺损的方法是肌肉转位替代疗法,这样就造成了另一块肌组织的损伤。在这种背景下,作者设计了该课题,寻找肌肉原位修复的方法。目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞在体外诱导分化为骨骼肌细胞的条件。方法:分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞,应用5-氮杂胞苷、成肌分化因子、转化生长因子β1、胰岛素样生长因子1联合进行诱导,使之分化。在诱导后的第9天,收集细胞,免疫组织化学法对细胞进行鉴定。结果与结论:原代培养的骨髓间充质干细胞呈贴壁、集落样生长,5～7d后有多突成纤维细胞、扁平多角形细胞、多角形细胞和三角形细胞。12d后,见细胞融合,铺满瓶底,骨髓间充质干细胞的形态变化不明显。经5-氮杂胞苷诱导后细胞,起初部分细胞死亡,生长缓慢。7d后见细胞明显生长,体积逐渐增大,呈椭圆形、梭形或不规则形状。14d后,大量增殖的长梭形细胞开始增多。18～22d后,肌管数量增多,体积增大,核数亦明显增多,初生肌管与长梭形成肌细胞呈平行排列,间隔分布。骨髓间充质/干细胞免疫组化法测定见CD44反应阳性,胞质呈棕褐颗粒,核周明显,CD34呈阴性反应。诱导后骨髓间充质干细胞免疫组化法测定见结蛋白、骨骼肌特异肌球蛋白均为阳性表达。结果提示在体外,成肌分化因子和5-氮杂胞苷可以诱导骨髓间充质干细胞向骨骼肌细胞定向分化,并伴有结蛋白和骨骼肌肌球蛋白阳性表达。

hBMSCs诱导分化类髓核细胞

目的探讨人椎间盘细胞和关节软骨细胞的分子表型差异,分析hBMSCs经TGF-β3和BMP-7联合诱导后能否分化为软骨细胞和髓核细胞。方法取9例自愿捐赠者髂嵴骨髓20～40mL分离培养hBMSCs。取第4代hBMSCs行三维微球培养。根据基础培养基中加入的生长因子不同,实验分成4组,分别为加入10ng/mLTGF-β3组(A组)、200ng/mLBMP-7组(B组)、同时加入两种生长因子组(C组)以及空白对照组(D组)。于培养后21d,行组织学及免疫组织化学观察;于培养后4、21d进行PCR检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅹ型胶原、蛋白多糖和SOX9基因的表达。结果培养后21d,HE染色示A组和C组细胞呈软骨细胞样形态特征,甲苯胺蓝染色及免疫组织化学染色Ⅱ型胶原表达呈阳性。B组和D组细胞形态无明显改变,PCR检测示培养后21d,A、C组SOX9、蛋白多糖、Ⅰ型胶原及Ⅱ型胶原表达较4d时明显增加(P<0.05)。B、D组Ⅰ型胶原表达较4d时明显增加(P<0.05),SOX9、蛋白多糖及Ⅱ型胶原较4d时无明显变化(P>0.05)。其中仅A组Ⅹ型胶原表达呈阳性。结论TGF-β3和BMP-7联合应用能促进hBMSCs分化更接近于椎间盘细胞,可能为椎间盘组织工程提供种子细胞。

腺病毒介导RNA干扰抑制核心结合因子α1表达阻断软骨细胞的肥大分化

背景:软骨细胞肥大分化是软骨内骨化启动的标志,也是软骨内骨化必不可少的步骤,它是一种级联反应,一旦启动就很难阻断,最终结果是形成骨骼结构。RNA干扰技术是一种转录后水平的基因沉默,相关研究显示采用RNA干扰技术阻断核心结合因子α1表达能够有效地抑制异位骨化形成。目的:利用RNA干扰技术抑制核心结合因子α1表达,从而阻断大鼠软骨细胞肥大分化。方法:构建沉默SD大鼠核心结合因子基因的腺病毒Ad-Cbfa1-si RNA。利用维甲酸及白细胞介素1α促进软骨细胞肥大分化,观察Ad-Cbfa1-si RNA对核心结合因子α1表达的抑制作用。利用核心结合因子α1免疫组化方法比较各组核心结合因子α1的表达从而分析软骨细胞的肥大分化情况。结果与结论:经维甲酸和白细胞介素1α诱导后,阴性对照病毒组软骨细胞出现肥大分化,核心结合因子α1的表达呈阳性反应;Ad-Cbfa1-si RNA组软骨细胞中未见核心结合因子α1明显表达。提示利用RNA干扰技术能够明显抑制核心结合因子α1的表达,从而阻断软骨细胞的肥大分化。

DMD的基因、细胞和药理学治疗研究进展

杜兴氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一种X连锁隐性遗传的进行性肌萎缩疾病，主要由抗肌萎缩蛋白基因缺陷引起。抗肌萎缩蛋白是一种肌纤维膜结构蛋白，在维持肌细胞膜结构完整性中起重要作用。目前此疾病的治疗手段主要有基因治疗、细胞治疗和药理学治疗。针对疾病的根本原因，基因治疗和细胞治疗通过传递正常基因或修正突变基因以及移植正常细胞，如干细胞来进行治疗；药理学治疗则主要针对抗肌萎缩蛋白基因缺陷引起的下游事件，运用各种药物来减缓DMD病理进程．从而改善患者的生活质量．延长寿命。主要概述DMD治疗的最新讲展．并分析目前尚存存的问颢．

关于“用于替代皮肤刺激试验的组织工程表皮模型的构建研究”一文的讨论

本期李中良等作者撰写的“用于替代皮肤刺激试验的组织工程表皮模型的构建研究”一文，展示了组织工程技术向非治疗目的转化的初步实践，至少释放出以下几个方面的信息。第一，不再以动物或人体模式为基础的医用产品毒理学、有效性评价系统已成为医药领域重要发展方向。任何一种新产品上市，除了严谨的基础科学研究外，均需要动物实验评价其药理、毒理及体内代谢过程，并经人体试验验证其安全性和有效性。

脱细胞肌腱片促进兔肩袖损伤腱-骨愈合的实验研究

目的评价犬脱细胞肌腱片(decellularized tendon slices,DTSs)对兔肩袖损伤腱-骨愈合的作用。方法取成年比格犬跟腱经反复冻融5次结合核酸酶处理12 h制备DTSs,体外对DTSs行组织学观察和细胞相容性评价。取成年雄性新西兰大白兔24只,体重2.5～3.0 kg,随机选取一侧肩关节自冈下肌腱止点处纵向作宽大于正常肌腱50%、长为8 mm的U形缺损,用犬DTSs修复冈下肌腱缺损并重建腱-骨止点(实验组);对侧肩关节不作任何处理(对照组)。术后4、8、12周取两组标本行组织学观察和生物力学测试。结果体外组织学观察示犬DTSs胶原结构保留完整,无细胞残留;细胞相容性实验示成纤维细胞与DTSs良好黏附。生物力学测试示,随时间延长,实验组最大载荷和刚度均呈增加趋势,12周时显著高于4周及8周(P<0.05);除12周实验组最大载荷与对照组比较差异无统计学意义(t=0.969,P=0.361)外,其余各时间点实验组最大载荷及刚度均显著小于对照组(P<0.05)。组织学观察示,对照组可见腱-骨止点的4层结构。实验组术后4周腱-骨界面由肉芽组织填充,少量类似Sharpey纤维连接于腱-骨间;随时间延长肉芽组织界面消失,成纤维细胞、Sharpey纤维、新生软骨和软骨细胞数量增多,腱-骨界面逐渐成熟,但未见位于矿化纤维软骨与非矿化纤维软骨间的潮线。结论经反复冻融5次结合核酸酶处理12 h制备的犬DTSs可促进兔肩袖损伤腱-骨愈合,提高肩袖损伤修复的生物力学性能。

成骨细胞条件培养液对BMSCs诱导分化作用研究

目的探讨大鼠成骨细胞条件培养液对同种大鼠BMSCs的成骨诱导分化作用,为骨组织工程种子细胞的获得寻找一种新方法。方法健康1周龄SD大鼠10只,雌雄不限,体重20～30 g,采用贴壁法和酶消化法分别获得BMSCs和成骨细胞,并进行鉴定。无菌条件收集第1～5代成骨细胞培养液上清,与完全培养基1∶1混合,制备成骨细胞条件培养液,与第2代BMSCs共培养为诱导组,相同代次BMSCs与完全培养液共培养为对照组。倒置相差显微镜下观察共培养后BMSCs形态变化,MTT法检测BMSCs生长情况,免疫组织化学染色检测共培养后BMSCs的ALP、ColⅠ、骨钙素(osteocalcin,OCN)蛋白的表达,采用RT-PCR检测ColⅠ、OCN mRNA的表达。结果诱导组共培养7 d BMSCs体积变大,细胞由长梭形展开为扁平形和多边形,并带有突起;9 d细胞呈集落状生长。细胞生长曲线示BMSCs数量随培养时间延长而增加,对照组增殖能力较诱导组强;诱导培养4～7 d,对照组细胞数量与诱导组比较差异有统计学意义(P<0.05)。诱导组培养12 d,ALP染色呈阳性表达;18 d出现钙结节;21 d ColⅠ和OCN呈阳性表达;对照组均呈阴性表达。RT-PCR检测示诱导组培养21 d有ColⅠ、OCN mRNA表达,对照组未见表达。结论体外大鼠成骨细胞条件培养液有明显的诱导同种大鼠BMSCs向成骨样细胞分化的作用。

巨大肩袖撕裂的治疗及研究进展

目的总结巨大肩袖撕裂的治疗及研究进展。方法查阅巨大肩袖撕裂临床治疗及实验研究的相关文献,并进行综合分析。结果巨大肩袖撕裂的治疗方法主要有非手术治疗、清创减压术、直接修复术、肌腱转移术以及各种材料修复,其疗效各异。近年来,出现了许多有关巨大肩袖撕裂治疗的实验研究,如基因治疗、细胞治疗和组织工程技术,有望为临床医生提供新的治疗策略。结论巨大肩袖撕裂的治疗对临床医生是一个挑战,治疗方案的选择需要从多方面考虑;传统手术方法修复断裂肩袖效果有限,巨大肩袖撕裂的研究和治疗技术尚需进行深入研究。

缺氧对hBMSCs和胎盘来源MSCs增殖的影响

目的比较hBMSCs和人胎盘基蜕膜MSCs(human placental decidua basalis-MSCs,hPDB-MSCs)在化学缺氧条件下的增殖情况,为寻找组织工程新的种子细胞提供理论依据。方法采用密度梯度离心法分离培养hBMSCs与hPDB-MSCs,流式细胞仪检测细胞表面标志物;CoCl2建立化学缺氧模型,MTT法检测两种细胞在不同CoC12浓度(0、50、75、100、125、150、175、200μmol/L)和不同时间(6、12、24、48、72和96 h)的增殖情况。结果流式细胞仪检测显示hPDB-MSCs与hBMSCs均表达CD9、CD29、CD44、CD105、CD106、人类白细胞抗原ABC(human leucocyte antigen ABC,HLA-ABC),不表达CD34、CD40L和HLA-DR;但与hBMSCs相比,hPDB-MSCs阶段特异表达的胚胎抗原1(stage-specifi c embryonic antigen 1,SSEA-1)、SSEA-3、SSEA-4、肿瘤排斥抗原(tumor rejection autigen,TRA)-1-60、TRA-1-81表达更高。化学缺氧12 h内,hBMSCs与hPDB-MSCs增殖均被抑制,12 h后均能促进增殖;与对照组比较,hBMSCs经150μmol/L CoCl2作用24 h出现显著增殖(P<0.05),hPDB-MSCs在75μmol/L CoCl2作用12 h后出现显著增殖(P<0.05)。结论与hBMSCs相比,hPDB-MSCs表达更高的胚胎干细胞特有表面抗原,同时对化学缺氧所致的增殖影响更为敏感,可能成为一种新的组织工程种子细胞来源。

大鼠BMSCs自发钙化过程中成骨相关基因表达谱的分析

目的分析大鼠BMSCs自发钙化过程中成骨相关基因表达谱的改变。方法取健康3日龄SD大鼠骨髓分离培养BMSCs并扩增至第4代,体外构建自发钙化模型。于培养7、14 d,倒置相差显微镜观察细胞生长状况及自发钙化进程,并行茜素红染色观察。分别于培养0、7、14 d时收集细胞进行基因芯片分析,并对差异表达基因进行生物信息学分析。实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)验证芯片分析结果。结果大鼠BMSCs在体外发生了自发钙化,并于培养7 d后细胞开始堆集,茜素红染色为弱阳性;培养14 d后细胞堆积明显并形成典型的茜素红染色阳性钙结节样结构。自发钙化过程中共检测到576个差异表达的基因探针,对应378个大鼠基因。其中0 d和7 d相比有359个差异表达的基因探针,而7 d和14 d相比只有13个差异表达的基因探针。差异表达基因依据表达模式不同可分为6类;依据生物学功能亲和关系,与骨细胞生物学密切关联的差异表达基因又可分为7大类,即血管生成、细胞凋亡、骨相关基因、细胞周期、发育、细胞通讯和成骨信号通路。基因功能关联性分析显示有12个在功能上联系密切的细胞周期类基因在自发钙化过程中发生了下调;此外,基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,Mmp13)、分泌型磷酸蛋白1(secreted phosphoprotein 1,Spp1)、Cxcl12、Mmp2、Mmp3、Apoe和Itga7与较多的差异表达基因存在功能上的联系。Spp1、Mgp、Mmp13、Wnt抑制因子1、Cxcl12和细胞周期素A2的RT-qPCR验证结果与基因芯片结果一致。结论细胞接种后的前7 d是决定大鼠BMSCs自发钙化的关键期。BMSCs自发钙化过程受细胞通讯类基因、骨相关基因、细胞周期类基因、TGF-β信号通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路和Wnt信号通路等多方面的共同调控。