基于纳米技术和分子工程的生物医学传感

探索和发展新的传感技术和方法在更加微观的尺度（比如说亚微米、纳米尺度）上原位、活体、实时地获取相关生物、医学信息，对人类疾病的机理研究、诊断和治疗等具有非常重要的意义。该文基于纳米技术和分子工程发展了一系列适合生物医学分析与研究的传感技术，包括基于生物功能化纳米颗粒、原子力显微镜（AFM）以及新型核酸分子探针的生物医学传感技术。

自下而上构建人工细胞及其生物医学应用

构建具有特定细胞模拟功能的人工细胞有助于探索天然生物细胞系统中复杂的生物反应过程和细胞功能,并为深入了解生命起源提供便利。对于人工细胞的构建方法而言,无论是基于自上而下的原则,还是基于自下而上的原则,在过去的几十年里,都取得了很大进展,并得到广泛应用。基于人工细胞构建策略的不同,人工细胞可分为“自上而下”的人工细胞和“自下而上”的人工细胞。自下而上的合成生物学是一个新兴的互补学科,它寻求从天然或合成成分中构建人工细胞。自下而上的合成生物学的目标之一是构建或模拟天然生物细胞中存在的复杂路径。人工细胞来源于脂质、聚合物、脂质/聚合物杂化体、天然细胞膜、金属有机框架和凝聚体等。真实细胞内各种物质如蛋白质、基因、线粒体等可以结合在人工细胞表面或包裹在人工细胞内部,从而使人工细胞被赋予各种功能。此外,人工细胞不仅可作为载药系统及信息交流载体,还可代替功能受损的细胞,恢复机体的正常运转。首先,介绍基于自下而上策略构建人工细胞的方法和分类;其次,讨论人工细胞的多种应用;最后,对人工细胞的未来发展前景进行展望。

纳米金颗粒增强信号的电化学生物传感器用于谷胱甘肽和半胱氨酸的检测

构建了一种高灵敏检测谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)的新型电化学生物传感器.先将富含T碱基的DNA1和DNA2探针分别修饰在金电极和纳米金颗粒(AuNPs)上,再加入Hg2+,通过形成T-Hg2+-T结构使AuNPs结合到金电极表面.当加入GSH(或Cys)后,GSH(或Cys)可以竞争结合T-Hg2+-T结构中的Hg2+,使AuNPs离开电极表面.由于AuNPs上修饰的DNA探针能够静电吸附大量电活性物质六氨合钌(RuHex),因此该过程可引起计时电量信号的显著变化,据此实现了GSH(或Cys)的高灵敏检测.该传感器的检出限达10 pmol/L,比荧光法或比色法降低了2～3个数量级.实验结果表明,该传感器具有较好的选择性.

维生素C/白藜芦醇纳米复合脂质体制备及其抗氧化性研究

本文以具有亲疏水特点的磷脂分子为基质材料,采用薄膜水化法制备了一种同时包载脂溶性白藜芦醇(Res)和水溶性维生素C(VC)的纳米复合脂质体(Lip@Res/VC),并将其用于细胞抗氧化研究。在Lip@Res/VC的制备过程中,以Res和VC的包封率以及脂质体的粒径、多分散指数和电位为指标,考察了Res和VC的最佳投入量。研究结果表明,分别选择Res为4.0 mg和VC为3.5 mg的投入量,制备的Lip@Res/VC的水合粒径为(92.29±5.41)nm,Res和VC的包封率分别为(85.13±5.37)%和(64.73±5.51)%。体外1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二胺盐(ABTS)自由基清除试验结果显示,Lip@Res/VC的抗氧化活性较只包载了Res的单一脂质体Lip@Res或只包载了VC的单一脂质体Lip@VC均显著提高。通过选择正常肝细胞(L02细胞)为模式细胞,研究了Lip@Res/VC的细胞内抗氧化效果,结果显示,Lip@Res/VC具有清除细胞内活性氧(ROS)的能力,对过氧化氢诱导的L02细胞氧化损伤具有保护作用。

基于磷酸化修饰的核／壳硅纳米颗粒药物缓释体研究

采用反相微乳液体系中功能化基团同步修饰方法制备了包载抗肿瘤药物平阳霉素(PYM)的磷酸化核/壳硅纳米颗粒(PYM-PO4SiNP),考察了不同量的磷酸化修饰试剂对PYM-PO4SiNP的影响.结果表明,随着磷酸化修饰试剂量的增加,制备的PYM-PO4SiNP的电位逐渐降低,其包载的PYM的释放速率逐渐加快,但对颗粒的粒径没有明显影响.本文选择能使药物平稳、缓慢释放的磷酸化修饰试剂用量,制备了稳定性好、药物缓释时间长的PYM-PO4SiNP,其载药量和包封率分别为7.2%和37.81%,通过与CNE-2细胞共培育后,可以使CNE-2细胞的存活率逐渐下降,而磷酸化核/壳硅纳米颗粒PO4SiNP载体本身是没有毒性的.这一研究工作的开展拓宽了核/壳硅纳米颗粒在药物载体领域中的应用.

pH响应的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备及可控释放

选择带负电荷且溶解度和分子结构对pH值非常敏感的聚丙烯酸作为封堵分子,采用静电吸附的修饰方法,制备了pH响应的MCM-41型介孔二氧化硅纳米颗粒.利用高倍透射电子显微镜(TEM)、X射线衍射(XRD)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)及比表面积分析等手段表征了介孔二氧化硅纳米颗粒的物理化学性质.以联钌吡啶染料分子作为模式客体分子,研究了pH调控下的模式客体分子在介孔二氧化硅纳米颗粒中的包裹及释放行为.结果表明,该介孔二氧化硅纳米颗粒对pH具有很好的响应性;在近中性条件下,带正电的二氧化硅纳米颗粒通过静电吸附作用吸附带负电的聚丙烯酸,导致介孔封堵,使包载的染料分子几乎无释放;客体分子的释放率随着pH值的降低而升高,当pH≤5时,染料分子显著释放,pH=1时客体分子的释放率高达98%,可以实现对包载客体分子的控制释放.该pH响应的介孔二氧化硅纳米颗粒载体具有制备简便、价格低廉和包载量大等优点,有望应用于药物的控制释放.

分子信标用于核酸连续复制过程的体外实时监测

利用分子信标核酸探针实时监测了核酸连续复制过程.分子信标不仅作为模板参与复制反应,而且同步将复制过程的信息转换为荧光信号,实现复制过程的体外实时监测.该方法不仅为DNA复制检测提供了一种实时研究手段,而且为核酸复制动力学及与复制相关疾病的深入研究提供了一种新的思路.

牛血清白蛋白介导合成的金纳米簇用于活细胞荧光成像

以牛血清白蛋白介导合成金纳米簇,并利用荧光分光光度计、纳米粒度及zeta电位仪以及非变性聚丙烯酰胺蛋白质电泳对其进行了表征.结果表明,该金纳米簇不仅荧光信号较强,而且在不同pH值溶液中荧光稳定性好.在此基础上进一步考察了金纳米簇与宫颈癌细胞(HeLa)间的相互作用.结果表明,该金纳米簇可成功进入活细胞内,在最佳的培育时间和金纳米簇浓度条件下可达到较好的活细胞荧光标记效果,且在经过细胞固定化处理后仍保持其标记形态.

单分子力谱研究活细胞上多药耐药相关蛋白1的表达

采用原子力显微镜的单分子力谱(SMFM)技术研究了多药耐药相关蛋白1(MRP1)与其抗体间的相互作用,并考察了人舌癌细胞系TCA8113经高剂量平阳霉素(BLM)反复间歇诱导前后细胞表面MRP1的表达差异.实验结果表明,MRP1与其抗体之间存在特异性相互作用力,当针尖运动速率为2.5μm/s时,作用力大小约为(182±35)pN;而且药物诱导后MRP1在人舌癌细胞上的表达明显增强.本工作为了解活细胞水平上MRP1的表达提供了新方法,有助于肿瘤细胞多药耐药性(MDR)的研究.

基于分子信标对hOGG1活性的定量分析

设计了一种含有8-oxoG碱基的新型分子信标,结合酶促反应发展了一种非同位素标记的人8-oxoG-鸟嘌呤糖苷酶1(hOGG1)的活性分析新方法,检出限可达0.0125 U/mL.此外,该方法还可用于快速考察金属离子对酶促反应的影响和肿瘤细胞中hOGG1活性水平的定量检测.实验结果表明,该方法简单、灵敏,有望用于肿瘤样品中hOGG1活性的高通量分析和hOGG1抑制剂的筛选.

信号肽功能化二氧化硅纳米颗粒的线粒体靶向作用研究

以N-(p-Maleimidophenyl)isocyanate(PMPI)为交联剂,将线粒体信号肽分子共价修饰到二氧化硅荧光纳米颗粒表面,构建线粒体信号肽功能化二氧化硅荧光纳米颗粒.采用荧光分光光度计、Zeta电位仪以及透射电子显微镜对修饰前后的二氧化硅纳米颗粒进行了表征.结果表明,信号肽可被成功修饰在纳米颗粒表面,并且纳米颗粒粒径在信号肽分子修饰前后没有发生明显变化.以分离纯化的细胞核作为对照,采用流式细胞术考察了信号肽功能化二氧化硅荧光纳米颗粒与分离纯化后的线粒体的相互作用.结果表明,线粒体信号肽修饰到二氧化硅纳米颗粒表面后依然保持良好的生物活性,能够介导二氧化硅纳米颗粒特异性识别及结合分离纯化的线粒体,从而为线粒体监测及其功能调控研究提供了新的思路.

基于锁核酸的高选择性新型分子信标

通过在分子信标的错配位点修饰锁核酸,不仅可有效地改善其单碱基错配识别能力,还可提高检测灵敏度.因而有望发展成为一种通用的提高分子信标单碱基错配识别能力的方法.

单壁碳纳米管的猝灭效应用于银离子的检测

基于单壁碳纳米管(SWNTs)良好的猝灭性能,发展了利用单链DNA(ssDNA)和单壁碳纳米管的荧光探针用于对Ag+进行检测的方法。其中富含C碱基的FAM标记的单链DNA(ssDNA)与单壁碳纳米管(SWNTs)发生π*π间的相互作用后,其荧光被猝灭。当有Ag+加入时,ssDNA会由于C-Ag+-C作用形成发夹结构,刚性增强从而脱离碳纳米管使荧光信号较好的恢复,据此可检测Ag+。该方法简便,避免了ssDNA一端标记荧光基团另一端标记猝灭基团的较为昂贵的标记费,对Ag+的检测下限为0.6nmol/L,可应用于实际水样中的检测。

基于纳米金颗粒放大的电化学传感器用于三聚氰胺的检测

三聚氰胺与胸腺嘧啶(T)之间能够通过三个氢键结合,以富T的DNA探针为识别元件,结合DNA修饰的纳米金颗粒放大技术,以电活性物质钌胺作为信号分子,发展了一种高灵敏检测三聚氰胺的电化学传感器,该传感器具有良好的特异性和灵敏度,检测下限低至0.5 nmol/L。

功能化硅壳磁性纳米颗粒亲和吸附介质靶向分离蛋白质研究

基于溴化氰修饰方法在硅壳磁性纳米颗粒表面修饰功能性生物分子,获得功能化硅壳磁性纳米颗粒亲和吸附介质。以胰蛋白酶-胰蛋白酶抑制剂作为模式亲和对,基于酶和抑制剂之间的特异性结合原理,首先考察了胰蛋白酶抑制剂的修饰对硅壳磁性纳米颗粒粒径和电位的影响及其修饰效率,然后利用胰蛋白酶抑制剂修饰的硅壳磁性纳米颗粒亲和吸附介质对简单模型蛋白质混合溶液以及胰脏组织中的胰蛋白酶进行靶向分离。该研究基于硅壳磁性纳米颗粒的内核磁性及表面生物修饰,为蛋白质分离提供了一种新型亲和吸附介质。

阳离子荧光共轭聚合物结合纳米颗粒用于DNA检测

利用纳米颗粒对目标DNA的富集、分离作用以及阳离子荧光共轭聚合物良好的荧光特性,建立了一种特异性检测DNA的新方法。首先将标记有猝灭基团的DNA捕获探针修饰到纳米颗粒上,捕获互补的DNA分子;然后加入S1核酸酶,除去未捕获到互补DNA的捕获探针;最后用DNaseⅠ将颗粒上的双链切断,使猝灭基团从纳米颗粒上解离下来,与阳离子荧光共轭聚合物结合并猝灭其荧光。结果表明,目标核酸的浓度与该聚合物的荧光猝灭程度正相关,且具有良好的特异性,线性响应范围为5.0～40nmol/L;检出限为3.7nmol/L(S/N=3)。

分子信标检测限制性内切酶活性的新型荧光分析方法

利用分子信标被切割后荧光信号的变化,发展了一种简便的检测限制性内切酶活性的新型荧光分析方法.以限制性内切酶XspⅠ为例,将其识别位点嵌入具有茎环结构的分子信标探针(Molecular Beacon,MB)的环状部分,利用这种分子信标在溶液中形成的瞬时二聚体结构,实现了限制性内切酶对分子信标的切割.在优化的条件下,反应初速度与酶的浓度成正比,线性范围为0.05～50U/mL,检测限为0.05U/mL.通过改变分子信标环部的识别位点的序列,还可以检测其他限制性内切酶如AluⅠ的活性.

基于分子信标和S1核酸酶检测锌离子的研究

S1核酸酶是能够特异性切割核酸单链的核酸酶,对锌离子有很强的依赖性,基于这一特性,发展了一种基于分子信标和S1核酸酶的锌离子检测新方法。结果表明该方法操作简单,不需要昂贵仪器,不涉及复杂的离子载体合成,对锌离子的检测下限为120μmol/L。

超淬灭分子信标的合成与性能研究

合成并纯化了普通DNA引物、常规分子信标和超淬灭分子信标,利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对产物进行解析,证明了其为目标产物。与cDNA杂交的结果表明,超淬灭分子信标的信背比达到40倍,比常规分子信标高出4倍,有望实现对样品的高灵敏检测。

基于核酸分子探针和工具酶的新型分子识别体系的研究进展

核酸分子探针利用了杂交高特异性以及设计、合成、标记方面的便利，已在生物、医学等诸多领域得到越来越广泛的应用。近年来，人们将核酸分子探针和各种工具酶相结合，发展了多种新型分子识别体系，在改善检测灵敏度、选择性以及生物分子相互作用信息的实时获取等方面取得了显著进展。