沉默REV7联合奥沙利铂诱导人结肠癌细胞THC 8307凋亡的研究

目的探讨抗肿瘤药物奥沙利铂(Oxaliplatin,L-OHP)联合沉默REV7基因对人结肠癌细胞THC8307细胞凋亡的影响。方法体外培养人结肠癌细胞株THC8307,将REV7基因的特异性siRNA片段转染THC8307细胞,运用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和Western blot法检测转染后细胞中REV7 mRNA和蛋白表达;运用MTT方法确定L-OHP对THC8307细胞的半数抑制浓度,实验分为不作任何处理的THC8307组、加药处理的L-OHP组,药物联合REV7 siRNA处理的L-OHP+REV7 siRNA组,采用细胞免疫荧光法检测THC8307细胞Bax、BCL-2的表达定位;采用流式细胞术(FCM)测定各组细胞凋亡率;Western blot法检测各组细胞Bax、BCL-2蛋白表达水平。结果与空白对照组相比,流式细胞术结果显示L-OHP、L-OHP联合REV7 siRNA组均能促进THC8307细胞凋亡,Western blot结果显示,L-OHP、L-OHP联合REV7 siRNA可明显下调凋亡因子BCL-2、上调Bax的蛋白表达水平、BCL-2/Bax灰度比值显著性下降(P<0.05),同时L-OHP、L-OHP联合REV7 siRNA两组相比较,后者较单独L-OHP组对THC8307细胞促进凋亡作用更加显著(P均<0.05)。结论 L-OHP联合沉默REV7基因可显著性地诱导人结肠癌细胞THC8307凋亡,发挥抗肿瘤作用。

胎牛血清联合FSH对玻璃化冻存小鼠卵巢的保护作用

目的观察玻璃化冻存液中联合添加促卵泡刺激素(follicle-stimulatiny hormore,FSH)与胎牛血清对卵巢的保护作用,为优化卵巢玻璃化冷冻保存技术提供科学依据。方法将3周龄雌性ICR小鼠卵巢分为新鲜对照组(FCG)、空白对照玻璃化冻存组(B-VCG)、FSH干预玻璃化冻存组(FSH-VCG)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)干预玻璃化冻存组(FBS-VCG)、FBS联合FSH干预玻璃化冻存组(FBS+FSH-VCG)5组,采用卵泡计数方法计算正常卵泡率,采用免疫组织化学方法及蛋白免疫印迹技术观察凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。结果 FBS+FSH-VCG组的正常卵泡百分比高于B-VCG组(P=0.012),FBS+FSHVCG组和FBS-VCG(P=0.751)和FSH-VCG(P=0.693)组比较差异无统计学意义(P>0.05);与FCG组相比,玻璃化冻存各组卵巢组织内的凋亡蛋白Bax表达均升高(P均<0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2表达均减少(P均<0.05);与B-VCG组比较,FBS-VCG、FSH-VCG和FBS+FSH-VCG组的Bcl-2蛋白表达较高(P均<0.05),Bax蛋白表达率较低(P均<0.05);在FBS+FSH-VCG组中,Bcl-2/Bax比值大于1,Bcl-2表达占优势,与B-VCG组相比差异有统计学意义(P=0.034),FBS+FSH-VCG组与FCG组Bcl-2表达相似。结论小鼠卵巢组织玻璃化冻存过程中胎牛血清和FSH的添加可以减少对卵巢组织的冷冻损伤,提高正常卵泡百分比,二者联合添加对卵巢的保护效果最好。

白藜芦醇对钛颗粒诱导小鼠巨噬细胞形成的破骨细胞数量及F-actin环面积影响观察

目的观察白藜芦醇对钛颗粒诱导小鼠巨噬细胞株RAW264.7形成的破骨细胞数量及F-actin环面积影响,并探讨其机制。方法将小鼠巨噬细胞株RAW264.7分为Sham组、Vehicle组、Low-Res组、Mid-Res组、HighRes组,Sham组加入完全培养基,Vehicle组加入钛颗粒+完全培养基,Low-Res组加入钛颗粒+完全培养基+白藜芦醇(1μmol/L),Mid-Res组加入钛颗粒+完全培养基+白藜芦醇(10μmol/L),High-Res组加入钛颗粒+完全培养基+白藜芦醇(15μmol/L)。各组细胞培养5天后,采用TRAP染色法检测各组破骨细胞数,采用鬼笔环钛染色法检测各组破骨细胞F-actin环面积,采用Realtime-PCR法检测各组细胞中TNF-α、IL-1βmRNA,采用ELISA法检测各组细胞中TNF-α、IL-1β蛋白,采用Western blotting法检测各组细胞p-p65、p-IκB蛋白。结果Vehicle组可观察到较多体积较大、酒红色、内含多个细胞核的破骨细胞,而应用不同浓度白藜芦醇干预后,破骨细胞数随着药物浓度的增加而减少;Sham组、Vehicle组、Low-Res组、Mid-Res组、High-Res组破骨细胞数分别为0、(145.31±7.87)个、(129.63±4.12)个、(85.51±3.65)个、(69.76±5.63)个,其中Vehicle组和Low-Res组破骨细胞数相比,P>0.05,其余组间相比,P均<0.05。Vehicle组可观察到少量较大的F-actin环,Low-Res组、Mid-Res组的F-actin环较Vehicle组略有减少,High-Res组多核细胞明显减少;Sham组、Vehicle组、Low-Res组、Mid-Res组、High-Res组F-actin环面积分别为0、(3642.31±987.01)μm2、(3265.75±871.98)μm2、(2497.45±712.61)μm2和(1741.81±716.07)μm2,组间相比,P均<0.05。Low-Res组、Mid-Res组、High-Res组细胞中TNF-αmRNA、IL-1βmRNA、TNF-α蛋白、IL-1β蛋白、p-p65蛋白、p-IκB蛋白相对表达量或表达水平均低于Vehicle组,且降低程度与白藜芦醇浓度有关。结论白藜芦醇呈浓度依赖性对钛颗粒诱导小鼠巨噬细胞株RAW264.7形成的破骨细胞数量及F-actin环面积产生抑制作用,其抑制作用的机制与NF-κB信号通路有关。

结核分枝杆菌TB10.4亚单位疫苗的构建及免疫原性研究

目的构建结核分枝杆菌TB10.4基因的原核表达载体,表达和纯化该蛋白,构建亚单位疫苗,并对其免疫原性进行研究。方法从重组质粒p ET-SUMO-TB 10.4获得基因片断后,将其插入到载体p ET-28a(+),转化Ecoli DH5α感受态细胞,随机筛选阳性克隆,测序正确后并将该重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析后,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化并复性。随机将C57BL/6雌性小鼠分为Tris-HCl组、TB10.4组(佐剂为DDA/Poly I∶C)及卡介苗(BCG)3组,每组10只,每只小鼠每次免疫200μL,其中DDA250μg及Poly I∶C 25μg,蛋白量为20μg,而BCG为5×106CFU,分别于1、4、7周皮下免疫小鼠。末次免疫4周后,用特异性抗原TB10.4刺激脾淋巴细胞,检测其分泌IFN-γ水平;用ELISA检测血清特异性抗体Ig G2b、Ig G1。结果构建了原核表达重组质粒p ET-28a-TB10.4,并在分子量约为10.4k Da处观察到蛋白条带;小鼠血清中产生特异性抗体Ig G2b与Ig G1,体外脾淋巴细胞受TB10.4刺激时分泌IFN-γ水平显著高于Tris-HCl组(P<0.05)及BCG组(P<0.05)。结论 TB10.4蛋白与佐剂构建了亚单位疫苗,该疫苗可在C57BL/7小鼠中诱导抗原特异性免疫应答,可作为新型结核亚单位疫苗的候选疫苗予以进一步研究。