肿瘤心脏病学的生理学基础

肿瘤心脏病学是对肿瘤病人在其恶性肿瘤的治疗期间所出现的心脏毒性的早期诊断、预防、治疗和监测。随着肿瘤学基础研究的深入及临床治疗的飞速发展,肿瘤病人的病死率逐年降低,从而引起肿瘤幸存者人数逐年升高。不幸的是,所有的抗肿瘤药物都具有不同程度的心血管毒性,所以肿瘤幸存者往往伴有心血管系统的并发症。其次,随着人口的老龄化,肿瘤与心血管疾病共患病人数逐年增加。再者,由于肿瘤与某些心血管疾病(如房颤)具有"共同发病机理",进一步增加了肿瘤和心血管疾病共患病的人数。因此,肿瘤或心血管病专家在管理越来越多的肿瘤-心脏病共患病病人时遇到了前所未有的挑战。为了全面、有效、及科学地管理肿瘤-心脏病共患病病人,预防肿瘤病人因肿瘤的治疗而诱发心血管疾病,及避免肿瘤患者因继发心脏疾病或心脏疾病患者因继发肿瘤而影响对其首发病的治疗,因而产生了肿瘤心脏病学。肿瘤心脏病学的目的在于联合心脏病和肿瘤专家、及基础、转化医学、和临床研究科学家来共同增进肿瘤幸存者心血管系统的健康。肿瘤心脏病学涉及的领域主要包括:对肿瘤患者的原发肿瘤及肿瘤患者同发或继发的心脏疾病的临床治疗;对肿瘤患者因放射及化学药物治疗而引起的心脏毒性的早期诊断;对肿瘤病人继发心脏疾病危险因素分层及预防;以及对肿瘤患者心脏病的治疗及对放化疗所引起的心脏毒性的治疗和监测。因此,肿瘤心脏病学不单是对肿瘤病人出现心脏并发症的临床治疗学,而且包括了推动肿瘤心脏病学赖以发展的基础研究,以阐明肿瘤心脏病的发病机理,从而为肿瘤心脏病的早期诊断、治疗、预防、及监测提供理论基础。

光标测技术在心脏电生理和心律失常研究中的应用

光标测技术(optical mapping)自20世纪末问世以来已逐渐成为心脏电生理研究的重要技术,主要原因是:一方面,荧光探针技术和高分辨率采集技术不断发展;另一方面,单细胞和整体水平电生理技术已无法满足目前的研究需求。光标测技术具有较高的时空分辨率、广阔的采样面积和较小的损伤等特点,可以直观、动态显示心脏整体的电传导和钙处理的动力学改变,在研究心脏电生理和心律失常发生机制时发挥了重要作用。光标测技术的基本原理是将电压和钙敏感染料灌注到心脏各个细胞,使用荧光激发两种荧光染料,发射光经滤波处理后被相机同时获取,采集系统可同时获得心肌膜电位和钙瞬变的高通量数据。通过后续数据分析,可获得动作电位和钙瞬变多个电生理参数及二者的耦联关系以明确疾病模型或药物干预下的电生理特性,从而揭示心律失常的机制和用于抗心律失常药物筛选。本文旨在介绍光标测技术及在常见疾病模型下的数据分析和应用,并为抗心律失常药物的研究提供技术参考。

神经系统相关疾病药物治疗新靶点:Hv1

电压门控质子通道(voltage-gated proton channel,Hv1)是一种对质子具有高选择性的通道,在神经系统中表达并发挥生理功能。Hv1通过跨膜转运质子,维持细胞内外的pH并参与活性氧的产生,进而参与多种神经系统相关疾病的调控。本文主要总结了电压门控质子通道在神经系统中的相关功能,以及对神经系统相关疾病的调控作用。

新生与成年大鼠心脏成纤维细胞来源外泌体蛋白质组学差异分析

目的幼体心脏具有再生修复功能,通过分析新生大鼠与成年大鼠心脏成纤维细胞来源外泌体的差异蛋白,从分子水平上探讨心肌受损后可能的治疗靶点。方法分别从新生和成年大鼠心脏成纤维细胞中分离出外泌体,并提取蛋白质进行高效液相色谱法(high per-formance liquid chromatography,HPLC)和液相色谱串联质谱法(liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)分析,鉴定差异表达的蛋白质。使用DAVID数据库对差异表达蛋白基因进行基因本体论(Gene Ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析。并进一步使用STRING数据库和Cytoscape软件进行蛋白质相互作用网络(protein-protein interaction,PPI)分析,以筛选出关键基因。结果在新生大鼠中共发现241个差异表达蛋白,其中上调表达的蛋白有117个,下调表达的蛋白有124个。GO分析显示上调表达基因主要涉及整合素介导的信号通路和对缺氧的反应,而对内肽酶活性负调控的基因下调表达。KEGG分析结果表明上调表达基因主要富集于Hippo信号通路,而下调表达基因主要涉及细胞外基质与受体相互作用。通过PPI分析得出有6个关键基因(Lamc1、Agrn、Itih3、Tfrc、Bgn和Atp5pd)下调,有1个关键基因(Rp17a)上调。结论通过蛋白组学和生物信息学方法,筛选出了新生大鼠和成年大鼠心脏成纤维细胞来源外泌体的差异蛋白,以及相关的信号通路和关键基因,为心肌受损精准治疗提供了潜在的靶点。

虚拟生理心脏模型及房颤机制研究进展

房颤是临床上最常见的持续性心律失常.揭示房颤的发病机制和病理生理过程是其诊断、预防、治疗、药物研发及临床设备设计的关键,而实验和临床只能呈现细胞或亚细胞的局部特性及房颤病症的宏观结果.随着生物信息技术、统计分析技术等的发展,运用多物理尺度的虚拟生理心脏模型,来实现宏观结果与微观机制相统一的研究方法备受关注.本文综述了离子通道、心肌细胞、心脏组织及器官等多尺度的虚拟生理心脏模型研究进展,探讨了近年来基于虚拟生理心脏模型的房颤机制研究以及房颤的治疗手段,提示了房颤研究的挑战和未来的发展方向.

转化生长因子-β1受体依赖的心肌纤维化伴随大电导钙激活钾通道的表达和功能下调

目的:探讨大电导钙激活钾通道(BKCa)是否参与转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的心肌纤维化过程,以及在这一过程中的作用机制。方法:分离培养乳大鼠心室成纤维细胞,并根据TGF-β1的不同浓度(5 ng/ml组、10 ng/ml组),以及在10 ng/ml TGF-β1基础上加入不同浓度TGF-β1受体特异阻断剂SB431542(0.1μmol/L组、1μmol/L组、10μmol/L组)进行分组,处理后提取蛋白及RNA,应用蛋白免疫印迹(Western blot)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组TGF-β1受体蛋白,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)、Ⅲ型胶原(CollagenⅢ)、BKCa蛋白和信使RNA(mRNA)的表达情况。单通道及全细胞膜片钳技术记录TGF-β1作用24 h前后的BKCa电流特点及其变化情况。结果:TGF-β15 ng/ml组和10 ng/ml组均上调TGF-β1受体蛋白,α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白和mRNA的表达,10 ng/ml组TGF-β1下调BKCa蛋白和mRNA的表达。与TGF-β110 ng/ml组相比,在10 ng/ml TGF-β1基础上加入SB4315421μmol/L组、10μmol/L组下调TGF-β1受体蛋白,α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白和mRNA的表达,加入SB43154210μmol/L组上调BKCa蛋白和mRNA的表达,差异均具有统计学意义。此外,单通道及全细胞膜片钳技术记录结果表明TGF-β1预处理24 h后可明显抑制成纤维细胞上BKCa电流。结论:BKCa可能参与了TGF-β1诱导乳大鼠心室成纤维细胞纤维化通路,其机制可能是TGF-β1抑制了成纤维细胞上BKCa的电流。这提示BKCa可能是防治心肌纤维化的潜在靶点。

重组小鼠白细胞介素11致小鼠心肌纤维化的实验探究

目的:观察皮下注射重组小鼠白细胞介素11(rmIL-11)对小鼠心脏结构功能的影响并明确其促进心肌纤维化的作用。方法:将C57BL/6小鼠随机分为实验组和溶媒对照组,实验组小鼠背部皮下注射rmIL-11,100μg·kg-1·d-1,连续注射3周;而对照组同法皮下注射等量的生理盐水。实验结束后,超声心动图测定小鼠心功能参数;取心脏称重,计算心重指数(CWI);HE染色和Masson染色分别观察小鼠心肌组织病理变化及纤维化程度,并计算心肌胶原容积分数(CVF);Western blot技术检测2组小鼠心肌组织中细胞外基质组分Ⅰ型、Ⅲ型胶原及纤连蛋白等蛋白表达的变化。结果:超声心电图结果显示实验组小鼠左室射血分数和短轴缩短率均明显降低(P<0.01),而左室舒张末期内径和收缩末期内径均明显增大(P<0.05)。与对照组比较,实验组小鼠CWI明显增大(P<0.01),心肌排列紊乱,肌细胞坏死增多,且细胞间可见大量胶原纤维沉积,相应地,CVF和左室Ⅰ型、Ⅲ型胶原及纤连蛋白表达水平明显增加(P<0.05)。结论:皮下注射rmIL-11能诱导小鼠心肌纤维化发生,揭示IL-11可能是一种新的促纤维化因子。

异丙酚对表达在HEK293细胞上的大电导钙激活钾(BKCa)通道的作用

目的:研究异丙酚对表达在HEK293细胞上的BK_(Ca)通道的作用,探讨异丙酚降低血压的作用机制。方法:将含有人血管平滑肌BK_(Ca)通道α亚单位(h Slo1)的表达质粒pc DNA3.1-h Slo1使用脂质体转染法(lipofectamine 2000)转染至培养的HEK293细胞,使用膜片钳全细胞和单通道记录方式研究异丙酚对BK_(Ca)通道的作用。结果:在全细胞构型下,56μM异丙酚能够明显增加BK_(Ca)宏观电流(P<0.01或P<0.05),在膜电位(Vm)为+60 mV时,56μM异丙酚明显增加BK_(Ca)宏观电流密度(87.29±7.10 pA/pF到131.21±9.68 pA/p F,n=6),两组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。在内面向外式膜片下,56μM异丙酚能够明显增加BK_(Ca)单通道开放概率(0.015±0.002到0.066±0.013,n=10),两组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:异丙酚能够明显激活表达在HEK293细胞上的BK_(Ca)通道,BK_(Ca)通道的激活可能参与了异丙酚介导的血管舒张。

低钾条件下TWIK-1双孔钾通道对小鼠心肌细胞膜电位的影响及其机制研究

目的:探讨在细胞外低钾条件下TWIK-1双孔钾通道对小鼠HL-1心肌细胞膜电位的影响及其分子机制。方法:构建载有人TWIK-1或TWIK-1-T118i突变体基因序列的慢病毒载体。通过病毒转染的方法使中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)或HL-1小鼠心肌细胞表达TWIK-1或TWIK-1-T118i突变体。通过膜片钳记录在细胞外正常钾(5.4 mmol/L)及低钾(2.7 mmol/L)条件下的膜电位及全细胞电流。结果:电流钳结果显示,在2.7 mmol/L钾条件下,表达人TWIK-1通道的CHO细胞及HL-1小鼠心肌细胞膜电位呈现去极化,当细胞外液的钠离子被替换为N-甲基-D-葡萄糖胺(NMDG)时,膜电位去极化现象消失;而表达人TWIK-1-T118i突变体通道的CHO细胞及HL-1小鼠心肌细胞膜电位呈现超极化。电压钳结果显示,在2.7 mmol/L钾条件下,在表达人TWIK-1通道的CHO细胞及HL-1小鼠心肌细胞可记录到内向阳离子电流,当细胞外液的钠离子替换为NMDG时,该内向阳离子电流消失。结论:在细胞外低钾条件下,TWIK-1通道介导的内向钠离子电流能够引起HL-1小鼠心肌细胞膜电位发生去极化。

中电导钙激活钾通道在细胞迁移中的作用及研究进展

细胞迁移参与个体发育、伤口愈合、免疫反应、癌症发展等多种生理或病理过程。钙激活钾(Calcium-activated potassium,KCa)通道作为钾通道家族中的重要成员,具有维持膜电位、胞内钙稳态和信号传递等作用。KCa通道参与多种细胞迁移过程,在细胞迁移中的调控机制具有重要临床价值。KCa通道依其单通道电导大小,分为大电导(BKCa)、中电导(IKCa)和小电导(SKCa)三类通道亚型。在细胞迁移相关研究中IKCa通道的报道较多,本文重点综述IKCa通道在细胞迁移中的作用及相关研究进展。

丹曲林对心肌缺血再灌注小鼠室性心律失常易感性的影响及其电生理机制:离体实验

目的评价丹曲林对心肌缺血再灌注小鼠室性心律失常易感性的影响及其电生理机制。方法SPF级健康雄性C57BL/6小鼠20只,6~8周龄,体重21~25 g,制备Langendorff离体心脏灌注模型。取离体灌注模型制备成功的心脏20个,采用随机数字表法分为对照组和丹曲林组,每组10个。采用停止灌流30 min后恢复灌流的方法建立全心缺血再灌注损伤模型。丹曲林组于再灌注时灌注含20μmol/L丹曲林钠的Krebs液5 min。再灌注10 min时,通过程序电刺激诱发室性心律失常,记录室性心律失常成功诱发情况和持续时间。于停灌前和再灌注20 min时测定心室有效不应期(ERP)及左心室中段外膜心肌细胞动作电位时程(APD50和APD90)。再灌注30~60 min时采用光学标测技术检测心肌细胞内钙离子浓度变化,记录钙瞬变交替发生情况及舒张期细胞内钙离子浓度自发升高(SCaE)幅度。结果与对照组比较,丹曲林组室性心律失常诱发率降低,持续时间缩短,再灌注20 min时心室ERP、APD50和APD90延长,钙瞬变交替发生率及SCaE幅度降低(P<0.05)。结论丹曲林可降低心肌缺血再灌注小鼠室性心律失常的易感性,其电生理机制可能与降低心肌细胞传导性和兴奋性、延长复极时程以及恢复胞内钙离子稳态有关。

补骨脂酚启动自噬减轻β-GP诱导的小鼠主动脉中膜钙化

目的:在选定的36种中药单体中筛选能够启动细胞自噬的药物;探究补骨脂酚对小鼠血管平滑肌细胞自噬的影响以及对血管平滑肌细胞钙化的影响。方法:从中草药中提取的黄酮类化合物以不同浓度处理人脑胶质瘤细胞(human glioma cells,U87)72 h,用MTT法得到药物对U87细胞的半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC_(50)),并以小于IC_(50)浓度的条件下以不同浓度梯度处理U87细胞,观察U87细胞GFP-LC3微管相关蛋白1轻链3(Microtubule-associated protein light chain 3,LC3)的荧光信号和Western blot检测自噬指标LC3从而观察细胞自噬活动激活情况,以筛选出能够启动自噬的药物。后续选取补骨脂酚进行进一步实验,探究药物启动自噬后对血管平滑肌细胞钙化的影响。使用β-GP构建小鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)钙化模型,分为对照组(C-CTR组)和钙化组(C-CAL组),并通过Western blot检测Runx2、BMP2及LC3的表达。使用补骨脂酚干预后,分为对照组(C-CTR组)、钙化组(C-CAL组)、钙化+补骨脂酚组(C-CAL+Administration组)、对照+补骨脂酚组(C-CTR+Administration组)4组,分别用Western blot检测LC3、Runx2和BMP2,用茜素红染色观察细胞钙化结节的形成。在动物实验中使用高脂饮食同时在腹腔注射维生素D的方式构建小鼠主动脉钙化模型,使用腹腔注射补骨脂酚的方式对小鼠进行干预,分为对照组(CTR组)、钙化组(CAL组)、钙化+补骨脂酚组(CAL+Administration组)、对照+补骨脂酚组(CTR+Administration组)4组。通过冯库萨染色观察主动脉中膜钙沉积情况,使用HE染色法观察小鼠主动脉中膜的厚度。结果:观察LC3的荧光强度和Western blot提示:细辛脂素(Asarinim)、补骨脂甲素(Bavachin)、灯心草酚(Juncusol)、桑黄酮(Mullberrin)、地榆皂苷2(Ziyuglycoside 2)、补骨脂酚(Bakuchiol)、补骨乙素(Corylifolinin)、五味子甲素(Schisandrin A)、五味子乙素(Schisandrin B)可以显著增加自噬小体的表达(P<0.05)。Western blot结果提示,在钙化的血管平滑肌细胞中,BMP2、Runx2以及LC3的表达显著增加(P<0.05)。使用补骨脂酚干预后Western blot结果提示BMP2和Runx2表达降低(P<0.05),LC3-Ⅱ表达显增加(P<0.05)。茜素红结果显示钙结节沉积也显著降低(P<0.05)。动物实验中,补骨脂酚干预后HE结果显示中膜厚度较钙化组显著增厚,冯库萨染色结果提示补骨脂酚可以显著减轻钙沉积。结论:补骨脂酚可以激活VSMCs的自噬,并减缓小鼠主动脉钙化的进程。

ASICs——治疗神经系统相关疾病药物作用的新靶点

酸敏感离子通道(acid sensing ion channels,ASICs)是一种可以被H+激活的质子门控阳离子通道。近年来研究发现,酸敏感离子通道参与癫痫、炎症性疼痛、缺血性脑损伤等神经系统相关疾病的病理过程,它被认为是治疗神经系统相关疾病药物作用的一个新靶点。本文主要综述酸敏感离子通道在神经系统相关疾病中的调节作用,以及酸敏感离子通道相关药物的最新研究进展。

机械敏感性离子通道Piezo对干细胞增殖、迁移、分化的影响

在细胞外的物理刺激如声、光、温度和机械力等转化为胞内生物信号反应的过程中,例如听力、疼痛、触摸、本体感觉、血压调节等,机械敏感性离子通道都在其中发挥了关键性作用。近年来,瞬时受体电位通道家族、机械活化双孔钾通道家族、上皮钠通道家族。

心肌梗死后心肌细胞来源的外泌体对心脏的影响

心肌梗死(myocardial infarction,MI)长期以来一直是冠心病死亡的主要原因,其特点包括不可逆的心肌细胞死亡和血流供应受限。外泌体是一种负载有RNA、蛋白质、脂质等生物货物的胞外囊泡,是旁分泌的重要介质,在MI后的心肌修复和信号传导等方面都发挥着重要作用。MI后,心肌细胞来源的外泌体可以部分反映心脏的病理状态,同时可能会加重心脏损伤,但也可能具有一定的治疗作用。因此,本文对近年来有关MI后心肌细胞来源的外泌体对心脏的调节作用及机制的相关研究进行评述,旨在进一步认识外泌体在心脏病理损伤中的效应机制,并为未来外泌体相关的临床研究提供参考。

注射异丙肾上腺素建立大鼠心肌肥厚模型

目的采用异丙肾上腺素诱导心肌肥厚,建立大鼠模型,并研究该动物模型的基本特性。方法大鼠背部皮下注射剂量为5 mg/kg的异丙肾上腺素,每日1次,连续注射14 d。结果模型组大鼠的全心重/体质量,左心室重/体质量均明显增加。模型组大鼠血清中羟脯氨酸(HYP)含量显著增加。模型组大鼠心肌组织中总超氧化物歧化酶(SOD)含量与对照组相比显著降低,而丙二醛(MDA)含量明显升高。结论皮下注射异丙肾上腺素14 d,可成功诱导大鼠心肌肥厚模型,为深入研究心肌肥厚的确切机制奠定基础。

一种有效急性酶分离大鼠心肌细胞及复钙的方法

目的:本研究旨在探讨一种既简便又高效的急性酶分离大鼠心肌细胞及有效复钙的方法,拟建立一种稳定高效分离大鼠心肌细胞且复钙后细胞成活率高的方法,为进一步研究单个心肌细胞的各种生理机制等诸多实验提供有利的前提保障。方法:应用II型胶原酶于Langendorff灌流装置下进行恒压或恒流灌流,得到横纹清晰、立体感较强的大鼠心肌细胞,然后应用三步法对心肌细胞进行复钙。结果:应用Langendorff灌流系统对大鼠心脏进行恒压或恒流灌流II型胶原酶,成功得到横纹清晰、立体感较强的大鼠心肌细胞,且复钙后在台式液中存活率仍然高达50%。结论:成功建立了一种既简便高效又稳定的急性分离大鼠心肌细胞且复钙后心肌细胞成活率较高的方法,为今后研究大鼠心肌细胞舒缩功能及其基本生理特性提供良好的单个细胞。

用重叠PCR策略构建抑制NF-κB活性的IKBA基因突变体

目的:用重叠PCR方法将IKBA基因三个碱基进行点突变A94G、G95C、T106G。方法:根据重叠PCR原理设计IKBA基因两条末端引物及A94G、G95C、T106G突变引物,从HUVEC细胞克隆IKBA基因,将其作为模板进行第一次PCR,将第一次PCR产物稀释10 000~50 000倍后作为模板,扩增突变体IKBAm,并克隆到p LVX-IRES-Zs Green载体,用双酶切及DNA测序筛选阳性质粒。结果:从HUVEC细胞克隆的IKBA基因及其突变体IKBAm基因长度均为954 bp,编码317个氨基酸,与IKBA基因相比,突变体IKBAm基因3个位点发生突变94A→G,95G→C,106T→G,编码的32/36位氨基酸由Ser突变为Ala。结论:成功克隆人IKBA基因及其32/36 Ser→Ala突变体IKBAm。

CDH1基因在SD大鼠舌黏膜癌变过程中甲基化和突变的研究

目的:通过甲基化和外显子突变研究探索CDH1基因在舌鳞状细胞癌发生过程中的作用。方法:采用质量分数为0.004%的4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline-1-oxide,4NQO)饮水饲养90只无特定病原体(specific pathogen free,SPF)SD大鼠以诱发舌黏膜癌变全过程,分别于第10、14、18、22、24周分批处死大鼠,取舌黏膜组织行病理分级,并提取基因组DNA。利用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MS-PCR)检测CDH1启动子甲基化水平;利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增CDH1外显子1-16,提纯后测序以检测突变。结果:病变各阶段均未检测出CDH1启动子甲基化产物,CDH1mRNA第2106位发生碱基G→T错义突变。结论:4NQO饮水诱导SD大鼠舌黏膜癌变的发生、发展可能与CDH1外显子突变有关而与CDH1启动子甲基化无关。

A型钾离子通道对人舌鳞癌Tca8113细胞增殖的影响

目的:探究A型钾离子(Potassium,K^+)通道抑制后对舌鳞状细胞癌株(Tca8113)细胞的影响。方法:全细胞膜片钳技术记录和分析A型K^+通道阻滞剂4-氨基吡啶(4-AP)对Tca8113细胞K^+电流的影响;MTT检测A型K^+通道对细胞增殖的作用。结果:在终浓度为2 mmol/L 4-AP作用下,A型K^+电流的峰值从(267.04±13.84)pA降到(124.81±5.24)pA。在一定范围内,不同浓度4-AP能抑制Tca8113细胞在体外的增殖,且抑制程度随药物浓度和作用时间的增加而增强。结论:A型K^+通道参与Tca8113细胞增殖的过程,且A型K^+通道阻滞剂能抑制Tca8113细胞的增殖。