人胚胎干细胞向生殖细胞分化的研究进展

小鼠胚胎干细胞体外已成功诱导分化为配子细胞,人胚胎干细胞理论上也具备分化为生殖细胞的潜能。本文从影响人胚胎干细胞体外向生殖系分化的基因调控和干细胞小生境(niche)方面进行综述,并指出胚胎干细胞在生殖医学及不孕治疗中的研究方向和应用前景。

鸡胚原始生殖细胞定向诱导分化为脂肪和神经元样细胞

目的探索培养传代后鸡胚原始生殖细胞（EPGCs）的多向分化潜能,比较不同诱导程序、不同特异性化学诱导剂及其协同作用。方法分别获取发育至19期和28期的鸡胚PGCs,体外培养传代到第4代。采用不同诱导程序、不同组合的诱导剂地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）诱导EPGCs向脂肪细胞分化。采用不同诱导程序、不同组合的诱导剂维甲酸（RA）、丁化羟基苯甲醚（BHA）I、BMX、二甲基亚砜（DMSO）诱导EPGCs向神经元样细胞分化。结果1.EPGCs被诱导7～21d后,分化成脂肪细胞,其中诱导程序（2）（见正文中叙述）的诱导分化效果较好,第192、8期分化率分别为89%和91%。诱导剂联合协同作用的诱导效果极显著地（P〈0.01）高于单独作用的诱导效果。诱导的脂肪细胞经特异性的油红O和苏丹红染色为阳性,并检测到特异性过氧化物酶体增生物激活受体γ（PPAR-γ）的表达。2.EPGCs被诱导3～7d后,分化成神经元样细胞,RAI、BMX单独使用对神经元样细胞的形成率分别为82%和83%,极显著地（P〈0.01）高于RA、BHA、DMSO和IBMX的协同作用的效果。诱导的神经元样细胞特异性免疫组织化学检测显示,均有神经元特异性烯醇化酶（NSE）和神经丝蛋白M（NFM）的表达,而无胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。结论鸡EPGCs体外培养传代后仍具有多向分化潜能,在特异化学物质的诱导下,可被定向诱导分化为脂肪细胞、神经元样细胞。

健康男性和弱精子症患者精液精子中GP130的表达

目的观察在正常和活动力低下的人精液精子中白细胞介素-6(IL-6)及其受体(IL-6R)和GP130的表达差异。方法收集活动力正常的人精液精子和A、B级精子低于20％的弱精子症患者的精液精子,采用逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)和免疫细胞化学的方法检测IL-6及其受体和GP130的表达水平。结果与活动力正常的精液精子比较, GP130在活动力低下患者精液精子的表达显著降低(P<0．01),本实验未检测到IL-6和IL-6R在人精液精子的表达。结论精液精子GP130的表达减少与人精子活动力低下相关,提示GP130表达减少可能是精子活动力低下的原因之一。

新基因TSBAG的生物信息学分析及其在小鼠睾丸组织中的表达

目的：筛选与精子发生相关的睾丸特异性新基因,并探讨其在精子发生过程中所起的作用。方法：将不同发育阶段的小鼠睾丸组织cDNA探针与Affymetrix全基因组芯片进行杂交,通过杂交信号的比较,筛选出差异表达的基因。用生物信息学软件对该基因进行生物信息学分析。RT-PCR分析该基因在小鼠不同发育阶段睾丸、小鼠不同组织中的表达。结果：通过4日龄、9日龄、18日龄、35日龄、54日龄和6月龄小鼠睾丸的芯片信号比较筛选出一个差异表达功能未知的新基因(GenBank登录号：BC049770),全长891 bp,含有702 bp的完整ORF,编码一个233个氨基酸、相对分子量为26．938 kD的蛋白质,我们将其命名为TSBAG(testis-specific BAG-like protein)。亚细胞定位预测显示,TSBAG基因可能在细胞核中表达。EBI功能域预测发现,在蛋白质序列8-62处有一个BAG功能域。RT-PCR分析表明,TSBAG基因特异性表达于小鼠睾丸组织中且具有时序性表达。TSBAG蛋白在人的同源基因GenBank登录号为AY349359,在233个氨基酸区域内有83%的同源性。结论：TSBAG基因在小鼠睾丸组织中特异性表达,且与小鼠精子发生过程一致。

小鼠精母细胞在体外分化为精子细胞

目的:探讨未成熟小鼠生精细胞在体外培养条件下的分化情况。方法:用支持细胞(TM4)条件培养液培养出生后14d的BALB/c小鼠睾丸细胞,对照组采用添加1%胎牛血清的MEM培养液维持细胞存活,在不同时段收获细胞,实时定量RT-PCR分析精子细胞特异性基因Tnp2表达的变化。结果:实时定量RT-PCR显示,在体内,Tnp2的表达随小鼠日龄增长而升高,与精子细胞发生过程同步;在睾丸细胞体外培养过程中,Tnp2的表达在TM4条件培养液培养d5显著升高(P<0.05),而对照组始终无变化。结论:在TM4条件培养液的作用下,小鼠精母细胞在体外分化为精子细胞。

人睾丸中各级生精细胞的鉴定

目的:建立人睾丸生精细胞鉴定方法。方法:用机械法离散人睾丸细胞,涂片,用D iff-Qu ik法染色显示细胞形态。在Hoffm an光学镜头下根据细胞形态进行活细胞分类,选取各类细胞分别涂片,行17号染色体着丝粒探针化学显色原位杂交和c-k it抗原表达免疫细胞化学染色。结果:在配置Hoffm an镜头的倒置显微镜下人睾丸圆形细胞主要可分为4群:支持细胞(Sertoli)细胞,粗线期初级精母细胞,精原细胞,圆形精子细胞。原位杂交结果为:Sertoli细胞、粗线期初级精母细胞、精原细胞均显示2个着丝粒信号,圆形精子细胞及精子显示单个着丝粒信号。抗c-k it抗体免疫化学染色显示:粗线期初级精母细胞、精原细胞反应呈阳性,Sertoli细胞、圆形精子细胞、精子反应呈阴性。结论:人睾丸各类细胞在活体形态、染色形态、染色体倍性、抗原表达上均有各自显著的特征,其中据Hoffm an成像形态区分各级生精细胞是在活体状态下一种简便有效的鉴别人生精细胞的方法。

一种新的脱细胞阴茎海绵体基质的制备方法

目的探索一种新的脱细胞阴茎海绵体基质的制备方法。方法取健康壮年兔完整阴茎海绵体组织,以Triton-X100与NH3.H2O(氨水)联合提取法进行脱细胞处理。标本作HE染色,组织学观察分析脱细胞效果。结果脱细胞处理25天后,成功获得脱细胞海绵体基质。所得基质外观良好。HE染色观察无细胞存在,弹力纤维排列规整,间隙较大,结构无破坏。结论利用Triton-X100与NH3.H2O联合提取法可成功制备完整无细胞阴茎海绵体基质。

体外培养方法诱导大鼠精母细胞减数分裂

目的:探讨大鼠睾丸精母细胞在体外减数分裂、分化为精子细胞或精子的可能性。方法:取出生后20-22dWistar大鼠睾丸组织,经胶原酶消化分离细胞,分别用含2%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基(对照组)和含2%FBS的DMEM/F12培养基+多种性激素+多种细胞生长因子等(实验组)作体外培养,于培养后d3、d7、d14收集细胞,采用流式细胞技术,检测培养前后生精细胞染色体倍体的变化;RT-PCR法检测精子细胞特异性基因过渡蛋白1(TP1)mRNA的表达。结果:培养d2,可见支持细胞贴壁生长,生精细胞粘附于支持细胞表面,实验组生精细胞存活率>90%,对照组<5%;培养14d,实验组可见长有鞭毛的长形精子细胞。流式细胞检测结果显示,培养前生精细胞为二倍体和四倍体细胞群,培养d14实验组单倍体细胞占总细胞数的6.2%,对照组未见单倍体峰。RT-PCR结果显示与流式细胞技术检测结果一致:培养前生精细胞未检测到TP1mRNA的表达,培养7d后实验组可检测到该基因的表达,培养14d,其表达量显著增加。结论:采用生精细胞与支持细胞混合培养并在培养液中添加性激素、细胞生长因子等的方法,大鼠精母细胞可以在体外进行减数分裂,分化成长形精子细胞。

人生精细胞体外分化的研究进展

哺乳动物生精细胞体外培养技术发展迅速,在人类,已经有体内发育阻滞生精细胞经体外培养发生分化,帮助生精阻滞患者生育遗传学后代的报道。研究较多的生精细胞体外培养和诱导分化的技术包括:生精小管片段培养、生精细胞-支持细胞共培养、生精细胞-Vero细胞共培养。人生精细胞体外分化由于研究例数少,目前技术还很不成熟,人体组织不易获得是限制人生精细胞体外分化研究的瓶颈。最新研究表明,通过建立人精原干细胞系,将有望为人生精细胞体外分化研究提供源源不断的研究材料。

CatSper基因家族在人和小鼠组织中的表达特征

目的研究CatSper基因家族在人和小鼠组织中的分布特点。方法将不同发育阶段的小鼠睾丸组织cDNA与Affymetrix全基因组芯片探针进行杂交,筛选出差异表达基因CatSper基因家族。RT-PCR验证差异表达基因在不同发育阶段的小鼠睾丸组织的表达特征,及其在人和小鼠不同组织中的分布。结果基因芯片分析发现CatSper1、CatSper2和CatSper3在小鼠睾丸的表达呈阶段特异性。RT-PCR结果表明该基因家族在睾丸的表达丰度明显高于其它组织;CatSper1和CatSper4在人体睾丸组织中特异性表达。结论CatSper基因家族在人和小鼠中呈现睾丸特异性表达或高表达,可能在精子发生中发挥重要功能。

睾丸特异性基因TSF22在小鼠中的表达研究

目的筛选与精子发生相关的基因。方法将4、9、18、35、54日龄和6月龄小鼠睾丸组织cDNA探针与Affymetrix全基因组芯片进行杂交,筛选出差异表达的基因。利用网络信息资源对该基因进行生物学信息分析。RT-PCR分析该基因在小鼠睾丸不同发育阶段及小鼠不同组织中的表达。结果芯片结果分析筛选出一个差异表达杂交点(GenBank登录号:NM_199034),生物信息学分析发现该基因全长1597bp,含有570bp的完整ORF,编码190个氨基酸、分子量为22.106kDa的蛋白质,我们将其命名为TSF22。RT-PCR分析表明TSF22基因特异性表达于睾丸组织及18日龄小鼠睾丸中。结论TSF22基因的表达与小鼠精子发生的过程一致,可能在精子发生中起重要作用。

同源盒基因-A10在人体睾丸组织的表达及其临床意义

目的比较同源盒基因-A10(HOXA10)在正常人和隐睾症患者睾丸组织的表达差异。方法收集正常人和隐睾症患者的睾丸组织,采用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)和免疫组织化学的方法检测HOXA10的表达水平。结果HOXA10在正常人和隐睾症患者的睾丸组织均有表达,与正常组织比较,HOXA10在隐睾症患者睾丸组织的表达显著降低。结论HOXA10的表达减少与隐睾症的发生有密切关系。

精子发生中几个关键基因的研究进展

精子发生是由最初的生殖细胞经过一系列复杂的、系统的变化,最终分化形成高度特异性的一类细胞———精子的生理过程。其中一些基因或基因家族发挥着至关重要的作用,它们的改变或缺失能够造成精子发生阻断或异形精子的生成,最终导致不育或生殖能力显著下降,如SCF/c-k it系统、HSP70-2、CREM、TBP及TLF等。本文将针对这几个基因或基因家族的研究进展作一综述。

小鼠雄激素受体真核表达载体的构建及稳定转染TM4细胞系的建立与鉴定

目的构建小鼠雄激素受体（androgenreceptor，AR）基因真核表达载体，转染TM4细胞，建立稳定转染AR的TM4细胞系。方法应用RT．PCR方法从小鼠睾丸中扩增AR，将测序正确的PCR产物克隆至pcDNA3．1（-）真核表达载体中，将载体以脂质体方式转染至TM4细胞，通过G418筛选稳定转染AR的TM4细胞株，以RT．PCR和Westem-blot检测AR在转染前后TM4细胞中的表达情况。结果成功构建了pcDNA3．1（-）Ag表达质粒，建立了稳定转染的TM4细胞系。RT-PCR和Western-blot检测结果表明，AR基因在该细胞系中成功表达。结论AR真核表达载体成功构建和稳定转染TM4细胞系的建立为进一步体外研究AR的功能奠定了基础。