高通量测序技术及其在微生物学研究中的应用

20世纪70年代发明的核酸测序技术为基因组学及其相关学科的发展做出了巨大贡献,本世纪初发展的以Illumina公司的HiSeq 2000,ABI公司的SOLiD,和Roche公司的454技术为代表的高通量测序技术又为基因组学的发展注入了新活力。本文在阐述这些技术的基础上,着重讨论了新一代测序技术在微生物领域中的应用。

登革热的实验室诊断

登革病毒是一种重要的虫媒病毒,主要通过白纹伊蚊和埃及伊蚊叮咬传播,其基因组为单股正链RNA,含单一的开放读码框依次编码3种结构蛋白（C、prM和E）和7种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）。

无针青霉素皮试法取代传统有针皮试的实验研究

目的:开展无针青霉素皮试法与传统皮试方法的比较研究,为无针青霉素皮试法提供实验依据。方法:建立青霉素致敏豚鼠模型,并以无针和有针皮试法检测致敏豚鼠及对照豚鼠,比较其阳性检出率、假阳性率、漏检率和皮肤病理损伤评价等临床指标。结果:无针及有针皮试法对豚鼠致敏模型的阳性检出率均为100%,无假阳性及漏检;且相较于传统有针皮试,无针皮试阳性结果更明显,造成的皮肤病理损伤更小。结论:无针青霉素皮试对过敏豚鼠检出精确,皮试阳性结果相比于传统有针注射更明显,并且无恐针情绪,造成法人皮肤病理损伤也更小,有望在临床上取代针头青霉素皮试法。

衣原体最新分类体系与分类鉴定方法研究进展

衣原体是一大类严格真核细胞内寄生、具有独特发育周期、与人类生活关系密切的细菌。近年来衣原体遗传学特别是比较基因组学研究,和新发衣原体如朱鹭衣原体、鸟衣原体、家禽衣原体等改变了旧的衣原体分类体系。最大的变化是嗜衣原体属被取消,该属原来的6个种被归到了衣原体属中,与新发衣原体一起使衣原体属扩展到了12个种。本文简要综述了衣原体分类现状与衣原体分类鉴定依据,包括传统的生物学特征、理化性质、分子遗传学方法及最近发展起来的全基因组分析。目前分子遗传学方法是衣原体分类鉴定的标准方法,包括16SrRNA、ompA与其它衣原体特有基因的序列分析等。

应用巢式RT-PCR结合RFLP、SSCP对山东肾综合征出血热病人血清中HV基因检测和分型研究

目的探讨山东肾综合征出血热重疫区病人血清中HV分子生物学特征,同时寻找准确、简便、迅速的HV检测与分型方法,从而为制定防治决策提供科学根据。方法从山东肾综合征出血热重疫区临沂市费县收集病人早期血清,应用巢式RT-PCR对病人血清中的HV进行基因扩增,采用RFLP、SSCP分型,并进行序列测定与分析。结果48份临床和ELISA检测确诊的HFRS病人血清经巢式RT-PCR扩增后,41份阳性,阳性率85.42%。41份阳性标本巢式RT-PCR产物经HindIII、HinfI酶切后,呈现2种不同的RFLP图谱:33份显示与R22株相似的酶切图谱,应属SEOV型;另外8份显示出与HTN76-118株相似的图谱,属HTNV型,这8份HTNV型标本均为10-12月间收集的病人血清。41份阳性标本巢式RT-PCR产物经SSCP分析,亦呈现2种不同的图谱:33份具有与R22株相似的SSCP图谱,应属SEOV型;而另8份则与HTN76-118株具有相似的SSCP图谱,属HTNV型。对部分扩增产物序列采用系统进化树分析也得出类似的结果:sdp1、sdp2、sdp3与HTN型76-118株亲缘关系相近,属同一簇,而sdp22、sdp37与SEOV型Z37、R22株亲缘关系相近,属另外一簇,这与RFLP和SSCP获得的结果相一致。结论山东肾综合征出血热重疫区病人基因型以SEOV型为主,但在秋冬季节也存在HTNV型。巢式RT-PCR结合RFLP、SSCP法可对HV准确分型,而且简便、迅速,适合于大规模流行病学调查。

鹦鹉热衣原体致病机制研究进展

鹦鹉热衣原体（Cps）是一种专性真核细胞内寄生,有独特的二相型发育周期,可形成具有感染能力的原体（EB）和具有繁殖能力的网状体（RB）,革兰染色阴性的细菌。Cps归类于衣原体科中的衣原体属,早期Everett等将其归类为嗜衣原体属,国内虽一直沿用这样的分类体系,但国际衣原体委员会已明确Cps属于衣原体属,同时取消嗜衣原体属分类。

中国硬蜱属（蜱目：硬蜱科）研究——系统分类与检索

硬蜱属Genus Ixodes Latrille公认有16个亚属，按此分类系统中国的硬蜱属成员归入5个亚属，即指名亚属Subgenus Ixodes （ s．str．） Latreille、隆头硬蜱亚属Subgenus Eschatocephalus Frauenfeld、殊须硬蜱亚属Subgenus Partipalpiger Hoogstraal， Clifford， Saito et Keirans、短须硬蜱亚属Subgenus Pholeoixodes Schulze 和盘窝硬蜱亚属Subgenus Scaphixodes Schulae。本文按亚属分类系统对中国的硬蜱进行了记述，并编制了分亚属检索表。

贝氏柯克斯体的分子致病机理研究进展

贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii,简写为Cb)是一类重要的人兽共患细胞内寄生菌,在家畜中广泛感染,感染人可导致不明发热—俗称Q热,或伴有肺炎、心内膜炎、肝炎、脊髓炎等。在我国Q热是一类被忽视的烈性传染病,误诊漏诊众多。需要警惕的是该病有突发爆发的可能。以荷兰为例,自2007至2010年,超过4 000荷兰人感染了Q热。近年来国外的Q热研究进展很快,特别是新出现的Cb无细胞培养和遗传学操作方法促进了Cb的致病机理研究,为研制新型实用的Q热防治策略提供了机遇。本文简要综述了Cb与宿主细胞间的相互作用机制,主要是脂多糖的免疫调节功能、囊泡发育机制及四型分泌系统的可能作用机理。

4种立克次体病的疫苗研究进展

立克次体是一大类专性真核细胞内寄生的原核微生物,常呈多形性,革兰阴性。根据第2版《伯杰氏系统细菌学手册》,立克次体目分为3个科,共16个属。多种立克次体是重要的人兽共患病原体,广泛分布于世界各地。立克次体可通过媒介昆虫的叮咬、排泄物、气溶胶进行传播。由于与媒介生物联系密切,此类传染病通常与战争、贫穷和落后卫生条件相关。随着经济的不断发展,立克次体病在我国已大幅降低。

规律成簇的间隔短回文重复：结构，功能与应用

规律成簇的间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPRs)是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的重复结构。最近研究表明,CRISPR与一系列相关蛋白、前导序列一起,为原核生物提供对噬菌体等外源基因的获得性免疫能力,其作用机制可能与真核生物的RNA干扰过程类似。作为基因组中高度可变的区域,CRISPR非常适合成为研究细菌种内分型和微进化的分子靶标。本文综述了CRISPR系统的结构、功能及其应用概况,并对CRISPR研究的前景进行了展望。

对1株疑似鼠疫耶尔森氏菌的系统鉴定

目的对1株可疑菌株进行系列验证实验,以确定其是否为鼠疫耶尔森氏菌(以下简称鼠疫菌)。方法用鼠疫细菌学常规方法和分子生物学手段确定其生物学表型特征、特异性基因及基因组特征。结果该菌株具备鼠疫菌的典型形态特征;能被鼠疫噬菌体完全裂解;主要生化特性为阿胶糖(+)、鼠李糖(-)、麦芽糖(+)、蜜二糖(-)、甘油(+)、脱氮(+),与典型鼠疫菌一致。毒力因子检查结果为均为阴性;对实验动物小白鼠完全无致死能力。全基因组芯片杂交实验和PCR扩增表明55023菌株没有鼠疫菌的三个质粒;也不具鼠疫标识基因;pgm位点代表性基因YPO1954扩增阳性,YPO1908扩增阴性,表明其pgm位点不完整;差异片段(DFR)分型结果表明该菌株缺失了14个DFR,不符合鼠疫菌的特征;多位点序列分型(MLST)分析结果表明该菌株与鼠疫存在16个碱基的差异,而与血清Ⅲ型假结核耶尔森氏菌仅相差两个碱基。结论尽管55023菌株具备鼠疫菌的一些表型特征,但基因组特征表明其不是鼠疫菌,而可能是血清III型的假结核耶尔森氏菌;噬菌体裂解结果等表型不能作为鼠疫菌鉴定的最终标准。

RIG-I样受体与RNA病毒识别

RIG-I样受体(RIG-I likereceptors,RLR)是一类新发现的模式识别受体,能够识别细胞质中的病毒RNA,通过RLR级联信号诱导干扰素和促炎症细胞因子的产生,对抗病毒天然免疫的建立起着非常重要的作用。RLR信号通路既受宿主的严格调控,也能够作为病毒逃避宿主干扰素反应的靶点。本文重点讨论了RLR及其在RNA病毒识别和抗病毒天然免疫中的作用。

安徽黄山地区中华硬蜱及其宿主感染莱姆病Borrelia afzelii的检测

利用PCR和病原体分离技术对安徽黄山地区中华硬蜱及其宿主感染莱姆病螺旋体的状况进行了检测，结果从40只黄山林区的中华硬蜱中获得了一株莱姆病螺旋体分离株，寄主动物及其他中华硬蜱均未获得阳性分离结果。以16srRNA为靶标进行PCR检测，6．78％雌性和5％雄性中华硬蜱发现有阳性感染，2只草兔（92只）和1只麂子（16只）也发现有阳性感染；若蜱和其余宿主动物未发现阳性感染。阳性分离株和扩增获得的16srRNA序列结果一致，同GenBank中的B．afielii的系统发育关系最近，提示该分离株螺旋体属于B．afzelii。该结果与前期的实验传播结果提示中华硬蜱是我国南方莱姆病的传播媒介。

鹦鹉热嗜衣原体两对荧光定量PCR引物的应用与比较

针对鹦鹉热嗜衣原体(Cps)的主要外膜蛋白(MOMP)基因和多形态膜蛋白(PMP)基因分别设计引物,建立荧光定量PCR方法,比较两对引物的灵敏度和特异性。试验结果表明,两对引物均可用于Cps检测,在样本中靶标浓度高时,PMP引物的检测灵敏度优于MOMP引物;但前者的扩增效率低于后者,后者更适合用于Cps的实时定量PCR检测。相对定量研究表明国内不同Cps流行株的PMP基因在基因组上的拷贝数可能存在较大差异。

中国蛙蠓新种——飞鹏蛙蠓的描述（双翅目：蛙蠓科）

2011年6月，在福建武夷山进行医学昆虫调查中发现蛙蠓1新种，命名为飞鹏蛙蠓Corethrella feipengi Yu，Huang et Zhang sp．nov．，此为我国蛙蠓科首次的新种描述。模式标本收藏于军事医学科学院医学昆虫标本馆。

呼肠病毒BYD株吸附蛋白σ1的原核表达及其抗原性鉴定

将呼肠病毒BYD株S1片段编码的细胞吸附蛋白基因连接至pET-28a(+),构建表达载体pET-28a(+)-S1,转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3),分析表达载体能否表达预期大小的重组σ1,并进一步鉴定重组σ1的抗原性。SDS-PAGE实验表明,经IPTG诱导后,表达载体能表达53kD左右蛋白质,与重组σ1的预期大小相符;免疫印迹分析表明重组σ1有较好的抗原性和特异性,可用于呼肠病毒诊断试剂的制备。

痘苗病毒载体在冠状病毒反向遗传学中的应用

反向遗传学方法是研究RNA病毒的主要方法,痘苗病毒载体则是感染性克隆技术的主要媒介,目前这一技术已趋向成熟并扩大其应用领域及对象。本文对痘苗病毒载体的构建、在冠状病毒反向遗传学中的应用情况以及目前该领域的进展作一综述。

沙眼衣原体质粒调控基因的上游序列有广泛的ChxR结合位点

目的:利用凝胶阻滞实验分析沙眼衣原体质粒调控基因的上游DNA序列与ChxR 的相互作用;方法:利用表达载体p ET-21b在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达ChxR ,重组蛋白的N端有T7标签、C端有6×His标签,用TALON金属亲和介质纯化重组蛋白;PCR扩增沙眼衣原体质粒调控基因的上游区约150 bp,连接p CR2.1载体,重组载体经单酶切,制备3'端生物素标记探针;用引物延伸实验确定glgA的转录起始位点,并合成5条glgA上游区的30 bp重叠探针;用凝胶阻滞实验分析ChxR 与以上探针的相互作用。结果:4个质粒调控基因的上游均有多个ChxR 结合位点,特别是glgA上游区至少有6个结合位点;glgA上游的ChxR 结合位点多位于启动子和启动子下游区。结论:ChxR 可能参与质粒调控基因的转录;在glgA转录中,ChxR 可能起转录抑制子的作用。

贝氏柯克斯体穿梭载体构建及转化方法建立

目的:基于大肠杆菌质粒pMMB207,构建贝氏柯克斯体穿梭载体,建立贝氏柯克斯体转化系统。方法:利用PCR分别扩增eGFP基因、Kan^R抗性基因、贝氏柯克斯体组成型表达启动子P311和P1169等4段序列,然后用融合PCR技术将4段序列融合为P311-eGFP-P1169-Kan^R串联序列,经KpnⅠ和XhoⅠ酶切后,连接至经同样双酶切的pMMB207骨架上,构建穿梭载体p207-GK;将穿梭载体电转化至贝氏柯克斯体,用ACCM-2培养基进行传代培养或感染BGM细胞;利用倒置荧光显微镜观察eGFP基因的表达,传代至eGFP基因高表达时,用半固体平板培养法克隆分纯贝氏柯克斯体转化株。结果:构建了贝氏柯克斯体穿梭载体,获得了稳定表达eGFP的贝氏柯克斯体转化株,并完成了克隆分纯。结论:建立了完整的贝氏柯克斯体转化系统,为后续用遗传学方法研究贝氏柯克斯体奠定了基础。