扶正祛邪法治疗小儿病毒性肺炎的临床与实验研究

小儿病毒性肺炎发病率高,对小儿健康威胁大,目前尚无满意的有效药物。病毒性肺炎多以高热为突出症状,属中医温病范畴。温邪上受,首先犯肺,最易耗伤气血阴液,治疗上宜选用养阴益气、清热解毒的方药。自1980～1990年间。

多聚酶链反应技术鉴别肾综合征出血热病毒血清型的初步研究

肾综合征出血热(HFRS)为一组抗原性密切相关的布尼亚科汉坦病毒引起的急性传染病。在我国存在至少两种临床表现、动物宿主及流行特征截然不同的血清型别,即血清Ⅰ型(汉坦型)和血清Ⅱ型(汉城型)。这两型病毒间的血清学定型已有报道。近年来,除啮齿类动物外,从临床病人以及非啮齿类动物体内也分离到了HFRS病毒。同时出现两类型别毒株共存,以及从家鼠体内分离到野鼠型毒株或从野鼠体内分离到家鼠型毒株的复杂情形。为此,准确检定并鉴别不同来源毒株型别,将为深入了解其病原学、流行病学以及制定疫苗生产策略提供重要信息。

人乳头瘤病毒16型治疗性疫苗联合免疫效果研究

目的:探索联合免疫策略对人乳头瘤病毒16型(HPV16)治疗疫苗L2E7E6和rAdE7E6的免疫效果的影响。方法:用L2E7E6融合蛋白和重组腺病毒rAd5E7E6以不同的联合免疫程序分别免疫C57BL/6小鼠,通过检测其诱发的体液免疫和细胞免疫反应,以及观察其在HPV16小鼠治疗模型中的抑瘤效果,比较分析联合免疫对小鼠免疫反应及治疗肿瘤效果的影响。结果:异源性联合免疫组均可检测到较高水平的体液免疫,该2组针对E6、E7特异性的T细胞免疫反应与同源性联合免疫2组相比明显提高,并在小鼠肿瘤治疗模型中能抑制肿瘤生长。结论:异源性联合免疫策略可明显提高HPV16 L2E7E6及rAd5E7E6疫苗的T细胞免疫反应,且有效治疗HPV16相关肿瘤,为HPV16L2E7E6及rAd5E7E6疫苗的应用提供了实验基础。

人乳头瘤病毒的致癌机理及其疫苗的临床试验研究

高危型人乳头瘤病毒(HPV)是引起宫颈癌的重要原因。诸多类型的HPV疫苗已经进入临床试验。在预防性疫苗中,嵌合型病毒样颗粒(cVLP)取得了不错的效果;在治疗性疫苗中,人们尝试了多肽疫苗,蛋白疫苗,DNA疫苗,病毒载体疫苗和联合免疫等方式,可以检测到所诱发的特异性免疫反应,但临床效果并不满意。无论预防性疫苗还是治疗性疫苗都面临着许多挑战。

SARS冠状病毒感染恒河猴的病毒、血清学检测研究

[目的]对感染SARS-CoV的恒河猴进行病毒、血清学等指标检测及研究,确定模型动物成功感染,并为SARS发病机制,疫苗评价,药物筛选确定参考指标。[方法]SARSCo-V经鼻腔接种8只恒河猴,在感染的第1天开始到5、7、10、15、20、30和60天分别安乐死时,不同时间取咽拭子、血液和脏器,进行病毒分离,RT-PCR检测和抗体测定。[结果]用巢式RT-PCR在感染后每天提取的咽拭子标本中检测SARS-CoV的RNA,以细胞培养冠状病毒为阳性对照,以正常恒河猴咽拭子为阴性对照,在8只动物病毒接种第5天开始可检测到大小为797bp的目的条带,阳性检出最长可持续到第15天。进一步用病毒分离实验对PCR结果进行确证,8只动物中的5只恒河猴接种5天的咽拭子标本中,经Vero细胞培养,细胞产生了典型细胞病变(CPE),提示SARS冠状病毒能感染恒河猴并有病毒的复制和排毒。IFA方法证实为SRAS-CoV抗原存在。SARS-CoV感染恒河猴后,可以检测出免疫反应。在SARS冠状病毒接种前和接种后第5、8、11、15、19、23、26、30、34、每隔4-7天以及安乐死时采血,制备血清测定抗体,8只恒河猴接种病毒前均血清中SARS冠状病毒特异性抗体IgG为阴性,10天后安乐处死的5只感染猴在11-15天开始,至安乐死时,均为阳性。IgG阳性的5只恒河猴均有一定的中和抗体产生,且对SARS病毒感染细胞有一定的保护性。感染SARS病毒猴后与正常猴比较,其细胞杀伤效应明显增强。感染SARS-CoV的恒河猴不仅出现与SARS患者类似的临床和病理学改变,也在一定时期内排毒,出现特异免疫反应,这些指标均可作为药物筛选、疫苗评价等方面的重要参数。

四川省首次分离出的风疹野病毒的基因型分析

[目的]为了解2006年引起一起风疹暴发疫情的风疹病毒的分子生物学特征,确定其基因型别。[方法]用Vero-Slam细胞从风疹暴发患者的标本中分离风疹病毒,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和序列测定与分析鉴定其基因型。[结果]四川省首次分离出的2株风疹野病毒全部鉴定为2B基因型。与3株WHO风疹病毒2B基因型参考株(I11-IS-68、TS34-CH-00和TAN-IND-00)核苷酸同源性分别为93.6%、95.6%和97.1%;氨基酸同源性分别为99.5%,99.5%和100%。[结论]此次疫情是由2B基因型风疹病毒引起的暴发疫情,此项研究为将来四川省风疹病毒的分子流行病学研究打下了基础。

穿心莲提取物和阿昔洛韦对EB病毒抗原表达抑制作用的对比实验

目的观察穿心莲提取物(炎琥宁)和阿昔洛韦(aciclovir)对EB病毒抗原表达有无抑制作用,并比较两者对EB病毒的作用强弱。方法免疫酶法测定炎琥宁及阿昔洛韦对Raji细胞早期抗原(early antigen,EA)的表达,分别计算出两者的阻断率(IR)。结果炎琥宁在无毒的浓度下,对Raji细胞EB病毒EA抗原表达有明显的抑制作用,阿昔洛韦在无毒的浓度下,对EB病毒EA抗原表达也有抑制作用。结论炎琥宁抑制EB病毒抗原的表达,其作用较阿昔洛韦为强。

人H5N1亚型禽流感病毒安徽株NS1基因的克隆及在原核系统的表达

利用RT-PCR方法,从人H5N1亚型禽流感病毒安徽株扩增到了NS1基因,对其进行了克隆、序列测定和分析,并在原核系统高效表达和纯化了NS1蛋白.进化分析表明,A/Anhui/01/2005毒株与近些年国内分离的水禽H5N1病毒进化关系更为接近.NS1与福建、湖南分离的禽流感病毒同源性最高,分别达到99.1%和98.2%.序列分析表明,与病毒的致病性相关的92位氨基酸为Asp,与病毒的细胞因子抗性相关的80～84位氨基酸发生缺失,与断裂/多聚腺苷酸化特异性因子结合的基序改变为GFEWN,和病毒致死性相关的PL基序为ESEV.随后在大肠杆菌高效表达并纯化了NS1蛋白.Ns1基因及其编码产物的特性分析以及在原核系统的表达,为进一步研究NS1的致病机制和抗病毒药物研制奠定了基础.

广西莱姆病的初步调查研究

莱姆病是一种人兽共患病，因该病1975年首先发现于美国康涅狄格州的莱姆地区而被命名为莱姆病。莱姆病的病原体已证实为伯氏疏螺旋体，其有多种动物宿主，主要通过硬蜱叮咬传播。

表达HPV16 L1、L2和E7蛋白的非复制重组痘苗病毒诱发的抗肿瘤免疫反应

目的:评价表达HPV16 L1、L2E7的非复制重组痘苗病毒疫苗的抗肿瘤免疫反应。方法:采用肿瘤预防、肿瘤治疗和肿瘤切除等方法,观察疫苗NTVJL1/L2E7的抗肿瘤效果,用酶联免疫斑点(ELISPOT)和CTL检测该疫苗在小鼠体内诱发的细胞免疫应答。结果:在肿瘤预防和肿瘤治疗试验中,疫苗可以分别使60%和50%的小鼠免受HPV16阳性的治疗细胞攻击,肿瘤切除试验中,疫苗可以使70%的小鼠免于肿瘤复发,与对照组之间的差异具有显著性。ELISPOT和CTL均检测出强的特异性细胞免疫水平。结论:NTVJL1/L2E7能够在小鼠体内诱发出理想的抗肿瘤免疫反应,可以作为防治宫颈癌的候选疫苗。

汉坦病毒核蛋白原核表达纯化及其单抗制备

目的制备稳定、特异的汉坦病毒核蛋白重组抗原和单克隆抗体。方法构建汉坦病毒(HTNV)-76118株核蛋白原核表达载体(pBV)220-S1.3和(pET)28a-S1.3,大肠埃希菌诱导表达。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western-blot分析显示,在48kD附近有目的蛋白表达,且有较好的抗原活性。用纯化的包涵体抗原免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经镍合氨基三乙酸(Ni-NAT)亲和纯化的核蛋白包被酶标板,进行ELISA筛选阳性克隆株,并建立细胞系,选2株高效分泌抗核蛋白单克隆抗体(McAb)的阳性杂交瘤细胞,常规制备腹水,进行单抗鉴定。结果成功构建了重组核蛋白原核表达载体pBV220-S1.3和pET28a-S1.3,获得了高纯度重组核蛋白(rNP)及其高效价单克隆抗体2E6和4D8。结论重组核蛋白抗原及其单克隆抗体在流行性出血热的监测、诊断和科研中有重要价值。

柯萨奇病毒A16型感染性模型的建立及其相关免疫学指标和应用的评价

目的建立简便和可靠的对柯萨奇病毒A16型(coxsackievirus A16,CVA16)敏感的小型啮齿类实验动物模型。方法选取不同日龄长爪沙鼠,腹腔接种CVA16后连续观察14 d,筛选出对病毒敏感的最适接种日龄段;然后比较接种剂量与效应关系,测定其50%致死剂量(LD50);并测定感染3 d后其血液和主要组织器官中CVA16病毒滴度;最后用CVA16灭活疫苗在1日龄和11日龄免疫2针沙鼠后,在14日龄时用LD50剂量病毒攻毒,观察并记录沙鼠体重、症状及死亡率,2周后眼球采血,应用微量中和试验和ELISA分别检测中和抗体效价和总抗体水平。结果长爪沙鼠感染CVA16后出现活动减少、后肢无力、麻痹瘫痪、死亡等临床症状,不同日龄沙鼠对CVA16感染的易感能力和感染后发病程度不同,7日龄和14日龄沙鼠易感,28日龄沙鼠不易感染,最敏感和最合适接种日龄为14日龄,其LD50为1×104.5 CCID50,感染3 d后其血液和主要组织器官中均可检测到高滴度的CVA16病毒,免疫两针灭活疫苗的14日龄沙鼠用LD50剂量攻毒,存活率87.5%,疫苗免疫诱导沙鼠产生的CVA16中和抗体几何平均值(GMT)为28.14,抗体阳性率为87.5%。结论长爪沙鼠对CVA16敏感并且病毒能在其体内进行有效的复制和繁殖,可作为CVA16致病机制研究、疫苗研发及药物评价的可靠小动物模型。

热毒净及阿昔洛韦对EB病毒抗原表达抑制作用的对比实验

[目的]观察热毒净及阿昔洛韦对EB病毒抗原表达有无抑制作用,并比较两者对EB病毒的作用强弱。[方法]免疫酶法测定热毒净及阿昔洛韦对Raji细胞早期抗原(EA)的表达,分别计算出两者的阻断率(IR)。[结果]热毒净在无毒的浓度下,对Raji细胞EB病毒EA抗原表达有较强的抑制作用,阿昔洛韦在实验的浓度下,对EB病毒EA抗原表达也有抑制作用。[结论]热毒净与阿昔洛韦比较能较强抑制EB病毒抗原的表达。

乙脑病毒E-Hsp70与E-肽连接区对小鼠特异性免疫的比较

在本实验室已构建的原核表达载体(含乙脑疫苗株SA14-14-2株E蛋白基因主要抗原片段)的基础上用巴斯德毕赤酵母系统表达,该片段长1113bp,编码371个氨基酸残基,研究酵母表达的该乙脑病毒(Japaneseencephali-tisvirus)E蛋白主要抗原片段与结核杆菌热休克蛋白70(Hsp70)的融合蛋白以及该抗原肽与Hsp70上的一个功能域-肽连接区(Peptidebindingdomain,以下简称BD)融合形成的蛋白,用这三种蛋白分别免疫BALB/c小鼠,以酵母单独表达的E蛋白主要抗原片段免疫作为对照,比较它们对小鼠抗E蛋白主要抗原片段特异性的细胞免疫和体液免疫的影响。采用腹腔内注射蛋白的方法免疫小鼠,主要从IL-2的mRNA水平,淋巴细胞的增殖和抗体滴度这三个方面进行比较,最后我们得出E-BD融合蛋白在免疫效果方面比E-Hsp70略好一些,所以在本试验中肽连接区是完全可以代替Hsp70独立行使其佐剂功能。

恒河猴感染SARS-CoV的病毒学、血清学检测

目的对感染SARS-CoV的8只恒河猴进行病毒学、血清学指标检测.方法SARS-CoV经鼻腔接种8只恒河猴,在感染的第1天开始到5、7、10、15、20、30和60天分别安乐处死时,不同时间取咽拭子、血液和脏器,进行病毒分离,RT-PCR检测和抗体测定.结果RT-PCR证实感染病毒检出时间为5～16 d,8只猴中的5只分离到了病毒,感染15 d后可检测到抗体.结论感染SARS-CoV的恒河猴不仅出现与SARS患者类似的临床和病理学改变,也在一定时期内排毒,出现特异免疫反应,这些指标均可作为药物筛选、疫苗评价等方面的重要参数.

一种SARS冠状病毒诊断基因芯片的研制

通过筛选SARS冠状病毒的基因序列,获得其有效检测的基因位点;利用已有的基因芯片技术,研制了一张用于SARS冠状病毒诊断的基因芯片。经临床标本检测验证,该基因芯片的粗符合率达到94.29%;检测灵敏度达到10-2/m l病毒分子,具有很好的实用性。

表达HPV16 L1、L2E7蛋白的非复制重组痘苗病毒的构建和鉴定

目的:构建防治宫颈癌的表达人乳头瘤病毒16型、HPV16)L1、L2E7蛋白的非复制重组痘苗病毒疫苗株。方法:以痘苗病毒为载体,利用同源重组技术筛选共表达HPV16L1、L2E7蛋白的重组痘苗病毒,用PCR和Western-blot技术进行鉴定。结果:该病毒在鸡胚成纤维细胞(CEF)中连续传代15代,经PCR检测证实病毒基因组中有HPV16L1、L2E7目的基因插入,Western-blot检测证实病毒可以稳定表达L1、L2E7蛋白。结论:构建的病毒NTVJL1L2E7可以在真核细胞中表达HPV16L1、L2E7蛋白,可以作为治疗和预防HPV16相关疾病的候选疫苗。

不同佐剂对人乳头瘤病毒16型L2E7E6蛋白免疫效果的影响

目的:研究CpG佐剂、弗氏佐剂、聚肌胞苷酸佐剂及左旋咪唑、西米替丁作为佐剂对人乳头瘤病毒16型L2E7E6融合蛋白在小鼠体内产生的免疫效果的影响。方法:以单独蛋白组、蛋白加各佐剂组分别肌肉注射免疫C57BL/6小鼠,检测不同佐剂诱发小鼠产生的体液免疫和细胞免疫应答水平,并观察其对小鼠肿瘤生长的抑制作用。结果:各免疫组均能检测到高滴度的抗L2、E7、E6蛋白IgG抗体(以IgG1为主),其中弗氏佐剂能显著提高E6蛋白的IgG和IgG1抗体水平和E7蛋白的IgG1抗体水平(P<0.05),CpG佐剂明显提高了E7蛋白的IgG2a抗体水平(P<0.01);而西米替丁佐剂则降低了E7抗原的IgG抗体水平(P<0.05);同时可以检测到CpG佐剂组能诱发小鼠产生针对E7、E6较强的细胞免疫反应,且能抑制70%的荷瘤小鼠肿瘤生长;此外弗氏佐剂与聚肌胞苷酸佐剂可产生较弱的针对E7肽的细胞免疫反应,能延缓荷瘤小鼠肿瘤形成时间,与单纯蛋白组相比差异显著(P<0.05)。结论:CpG佐剂、弗氏佐剂和聚肌胞苷酸佐剂都能提高人乳头瘤病毒16型L2E7E6融合蛋白的细胞免疫反应水平和抑制肿瘤生长能力,其中CpG佐剂效果较好,为促进该蛋白作为疫苗的研发提供了实验依据。

华北地区人群和商品猪戊型肝炎病毒感染的调查

戊型肝炎（HEV，简称戊肝）是人畜共患疾病，是20世纪80年代初被认识的一种病毒性肝炎，由戊肝病毒（HEV）感染引起的一种急性自限性肝炎。目前已被世界卫生组织（WHO）认为是发展中国家的一个重要公共卫生问题。1997年Meng等首次从美国本地猪中分离出野生株HE病毒．由此也揭示了动物作为戊型肝炎传染源的可能性。HEV主要经粪一口途径传播感染人和猪，可呈流行或散发两种形式，常常会通过食用被HEV污染的食物或与HEV携带者密切接触而感染，当水源被含有HEV的粪便污染后会引起大规模爆发流行。为了解华北地区人群和商品猪HEV的感染情况，对来自华北地区不同区域的两组人群和成年猪进行了HEV感染的抗体检测。