低剂量辐射增强荷瘤小鼠巨噬细胞功能的实验研究

采用Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠右后肢腓肠肌内接种Ｌｅｗｉｓ肺癌细胞做为实验动物模型，在肿瘤接种后１０ｄ，给予荷瘤小鼠７５ｍＧｙＸ射线全身照射，照射后１８ｈ处死。检测小鼠腹腔巨噬细胞（Ｍ）的肿瘤细胞静止效应，并采用原位杂交免疫组织化学方法测定腹腔Ｍ内肿瘤坏死因子α（ＴＮＦα）和白细胞介素Ｉβ（ＩＬ１β）的ｍＲＮＡ转录水平。结果显示，受照射小鼠的Ｍ肿瘤静止效应由假照射组的５２．９±８．１％增至７９．９±４．２％（ｐ＜０．０１），Ｍ内ＴＮＦα和ＩＬ１β的ｍＲＮＡ转录水平亦有明显提高。照射组的Ｍ内转录活性增高的阳性颗粒增多，染色加深，平均光密度值（ＭＯＤ）由０．２０４±０．００５，０．２１６±０．０１５分别增至０．２７２±０．０１２和０．２８５±０．００５，具有显著的差异（ｐ＜０．０１）。提示小剂量辐射可显著增强荷瘤小鼠的Ｍ的功能。

低剂量X射线全身照射后小鼠IL-10和IL-12的反向变化

通过检测低剂量辐射 (LDR)对小鼠脾淋巴细胞中IL - 10以及腹腔巨噬细胞中IL - 12的影响 ,研究LDR辐射免疫效应的机制。采用Northernblot检测了 75mGyX射线全身照射后 ,IL - 10、IL - 12mRNA水平的变化 ,同时分别通过流式细胞术和ELISA检测了IL - 10、IL - 12蛋白水平的变化。(1)Northernblot检测表明 ,75mGyX射线全身照射后脾细胞中IL - 10的mRNA转录水平从照射后 1h即降低 ,并维持较低水平 ,一直到 4 8h开始恢复 ,达到假照射水平的 86 .2 % ;巨噬细胞中IL- 12两亚基的mRNA水平的变化则表现为 ,照射后 1hp35及p4 0亚基均迅速升高分别达到假照射组的 131%和 192 %。而后 ,p35开始回降 ,直至照射后 16 - 4 8h恢复正常 ,p4 0亚基从照射后 1-4 8h总体表现为升高。(2 )对蛋白产物检测结果表明 ,脾细胞IL - 10合成在照射后 2h开始即呈时间依赖性降低 ,至 4 8h仍无恢复迹象 (p <0 .0 1) ,双抗体夹心酶联免疫吸附法 (ELISA)检测表明 ,巨噬细胞分泌IL - 12明显增高。LDR引起IL - 10和IL -

低剂量辐射抑制辐射诱发小鼠胸腺淋巴瘤的免疫学机制

为探讨低剂量辐射对高剂量辐射诱发小鼠胸腺淋巴瘤抑制作用的免疫学机制，采用４次１．７５ＧｙＸ射线全身照射Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠诱发胸腺淋巴瘤模型，检测不同辐射剂量照后１个月小鼠脾脏ＮＫ细胞毒活性及其ＩＬ－２和γ－ＩＦＮ分泌活性，腹腔巨噬细胞吞噬功能及其ＴＮＦ－α分泌活性。结果显示，每次１．７５Ｇｙ照射前１２ｈ接受７５ｍＧｙ照射小鼠，上述免疫功能均比单纯１．７５Ｇｙ照射组增强，且接近假照射组小鼠。提示低剂量辐射抑制高剂量辐射诱发胸腺淋巴瘤可能与低剂量辐射诱导的适应性反应，减轻高剂量辐射对机体免疫功能的损伤有关。

不同剂量X射线照射对小鼠巨噬细胞表达CD80和CD86的影响

采用免疫组织化学法观察了X射线全身照射对小鼠腹腔巨噬细胞及体外照射对培养的小鼠巨噬细胞株J774A .1细胞表达CD80和CD86的影响。结果表明 ;全身照射和体外照射时 2GyX射线诱导CD80表达增高均较 0 .0 75Gy为早 ,而CD86对两种剂量的反应无明显区别。剂量效应关系的研究表明 ,CD80和CD86的表达无论全身照射或体外照射时均在 0 .0 75Gy剂量点出现峰值 ,而在较大剂量照射时出现第二个峰值的剂量则全身照射高于体外照射。实验结果显示 。

p53 和 Bcl-2/Bax 在辐射诱导胸腺细胞凋亡中的作用

采用流式细胞术对昆明小鼠接受７５ｍＧｙ和２ＧｙＸ射线全身照射后，胸腺细胞内细胞凋亡相关基因ｐ５３、Ｂｃｌ－２和Ｂａｘ蛋白的表达进行了比较研究。结果表明，７５ｍＧｙＸ射线全身照射后２４ｈ，ｐ５３基因蛋白产物的表达显著降低（Ｐ＜０．００５），而２ＧｙＸ射线全身照射后２４ｈ，ｐ５３基因蛋白表达则显著增高（Ｐ＜０．００５）。７５ｍＧｙＸ射线全身照射后２４ｈ，Ｂｃｌ－２／Ｂａｘ比值明显增加（Ｐ＜０．０５）。而２ＧｙＸ射线全身照射组，Ｂｃｌ－２／Ｂａｘ比值无明显变化。提示：ｐ５３和Ｂｃｌ－２／Ｂａｘ在辐射诱导的胸腺细胞凋亡中起着重要作用。

电离辐射对小鼠骨髓造血细胞周期进程的影响

采用流式细胞术（FCM）观察了X射线全身照射后小鼠骨髓造血细胞周期进程的时程变化和剂量效应关系，为探讨电离辐射对小鼠骨髓细胞周期进程的影响，。结果显示，2GyX射线全身照射后12h骨髓细胞出现G1期细胞百分数升高（p＜0．05），4hS期细胞百分数下降（p＜0．05），G2＋M期细胞百分数于照后4h和12h升高（p＜0．05）。量效研究显示，0．5～6Gy照射后12hG1期细胞百分数高于对照组，其中1、2、4、6Gy照射组有统计学差异（p＜0.05～p＜0.01），S期细胞百分数呈剂量依赖性下降（p＜0．01～p＜0．001），G2＋M细胞百分数呈剂量依赖性增加（p＜0．05～p＜0．001）。提示2GyX射线全身照射后可诱导造血细胞出现G1、G2期阻滞，抑制DNA合成，并且这些变化在0．5～6Gy范围内呈剂量依赖性关系。

X射线全身照射对免疫器官内NF-kB的DNA结合活性的影响

采用凝胶电泳移动变化分析（ＥＭＳＡ）方法，观察了 Ｘ射线全身照射后小鼠胸腺细胞及脾细胞内 ＮＦ－ｋＢ ＤＮＡ结合活性的时程变化及其剂量效应关系。结果表明；胸腺细胞及脾细胞核蛋白提取物内存在两种与 ｋＢ位点特异结合的 ＮＦ－ｋＢ二聚体。 照射后两者的变化时程及剂量效应关系显然不同． ２Ｇｙ照射后胸腺细胞内 ｐ５０／ｐ６５的 ＤＮＡ结合活住在 ２４～４８ｈ稍有升高，而 ｐ５０／ｐ５０的 ＤＮＡ结合活性在照射后很快开始上升，于 ４ｈ达峰值，维持于高水平至 １２ｈ后逐渐下降。 照射后 １２ｈ电离辐射诱导 ｐ５０／ｐ６５复合物活性变化不明显，当剂量达 １Ｇｙ以上时ｐ５０／ｐ５０的ＤＮＡ结合活性呈剂量依赖性升高。提示，中等以上剂量的电离辐射主要诱导具有转导抑制作用的复合物．对脾细胞核蛋白提取物剂量效应关系及２Ｇｙ照射后的时程研究表明，较低剂量辐射对 ｐ５０／ｐ６５ 二聚体的表达有轻度刺激作用，较高剂量则显示抑制效应，而对 ｐ５０／ｐ５０二聚体的活住几乎无影响．提示，ＮＦ－ｋＢ在不同免疫器官内的构成及其对电离辐射的反应存在着差异。

电离辐射对小鼠胸腺细胞和脾细胞p53基因mRNA和蛋白表达的影响

采用流式细胞术和 Northern blot法检测了不同剂量 X射线全身照射后 ,小鼠胸腺细胞和脾细胞中 p53基因 m RNA和蛋白表达的变化。结果表明 ,2 .0 Gy X射线全身照射后 ,小鼠胸腺细胞 p53阳性细胞百分数与对照相比 ,在照后 1h开始升高 ,8h达最高 ,以后逐渐下降。不同剂量 X射线照射后 ,小鼠胸腺细胞和脾细胞中 p53基因 m RNA水平的观测结果表明 ,75m Gy及 2 .0 Gy全身照射后 1～ 4 8h,小鼠胸腺细胞和脾细胞中 p53m RNA水平均未见明显的变化 ;0 .5～ 6.0 Gy X射线全身照射后 4 h,小鼠胸腺细胞和脾细胞中 p53m RNA水平亦未见明显的改变。结果提示 ,X射线全身照射可诱导小鼠淋巴细胞 p53蛋白表达 ,其 p53蛋白表达增加是通过转录后机制实现的。

电离辐射对EL-4细胞的p53蛋白及其下游基因MDM2 mRNA和蛋白表达的影响

采用流式细胞术和 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ杂交检测了 Ｘ射线照射后 ＥＬ－４细胞中 ｐ５３蛋 白及其下游基因 ＭＤＭ２ｍＲＮＡ和蛋白表达的变化，以探讨 Ｘ射线照射诱导 ＥＬ－４细胞 Ｇ１期 阻滞的分子机制。结果表明：经 ４Ｇｙ Ｘ射线照射后的 ＥＬ－４细胞， ｐ５３蛋白表达在照射后 ２ｈ增 高， ４ｈ达峰值，持续至照射后 ２４ｈ（ｐ＜ ０．０５～ ０．００１）； ＭＤＭ２蛋白的表达在照射后 ４～２４ｈ 明显升高（ｐ＜ ０．０５～ ０．０１）。进一步观察 Ｘ射线照射后 ＭＤＭ２ ｍＲＮＡ 水平的时程变化后 发现，在经 ４Ｇｙ Ｘ射线照射后的 ＥＬ－４细胞中， ＭＤＭ２ ｍＲＮＡ水平在照射后 １～８ｈ有增高 趋势，其中， ２ｈ明显升高（ｐ＜０．０１）。结果表明； Ｘ射线照射 ＥＬ－４细胞可通过 ｐ５３蛋白诱 导 ＭＤＭ２蛋白表达，从而限制 Ｇ１期阻滞的时间，使 ＤＮＡ损伤修复后的细胞重新进入细胞周 期。

电离辐射对HelaS_3细胞凋亡与细胞周期的影响

研究了电离辐射对HelaS3 细胞凋亡和细胞周期的影响 ,进一步探讨细胞凋亡与细胞周期的关系 ,为肿瘤放化疗方案的制定提供基础资料。采用PI、Hoechst33342双染和PI单染 ,用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。结果表明 ,给予 0 .5 - 4 .0GyX射线照射后 8h细胞凋亡开始增加 ,12h达最大值 ,12 - 2 4h有下降趋势 ,但 2 4h开始又逐渐增加 ,到 72h时又接近 12h水平。S期和G2 /M期细胞均明显增加 ,并呈剂量依赖性 ,G0 /G1期细胞则呈剂量依赖性减少 ,且这种变化在受照射后 2 4h最明显。说明一定剂量电离辐射可以诱导明显的G2 /M阻滞和S期阻滞 ,并可诱导HelaS3 细胞凋亡的产生 ,两者之间有一定的关系。

低剂量辐射诱导胸腺细胞凋亡及细胞周期进程适应性反应的剂量效应

本研究采用 X射线全身照射昆明系雄性小鼠模型 ,通过流式细胞仪观察低剂量辐射诱导胸腺细胞凋亡及细胞周期进程适应性反应的诱导剂量 (D1 剂量 )及其后攻击剂量 (D2 剂量 )的剂量范围。动物随机分为假照组、D2 对照组和 D1 + D2 实验组。结果表明 ,D1 + D2 组胸腺细胞凋亡小体百分数不同程度地低于 D2 组 ,并且减轻 G1 和 G2 + M期阻滞 ,导致 S期 DNA合成的细胞增加 ;当 D1 达 2 0 0 m Gy时 ,不再诱导胸腺细胞凋亡及细胞周期进程的适应性反应。本实验结果说明 ,D1 在 2 5～ 1 0 0 m Gy(剂量率为 1 2 .5m Gy/min) ,D2 在 1 .0～ 2 .0 Gy(剂量率为 0 .2 87Gy/min) ,接受 D1 和 D2 照射的时间间隔为 6 h。

电离辐射诱导金属硫蛋白在小鼠免疫器官中的表达

观察了电离辐射对金属硫蛋白（ＭＴ）在免疫器官中表达的影响。采用放射性１０９Ｃｄ血红蛋白亲和分析法检测组织中 ＭＴ含量。观察 ０．５、 ２、 ４、 ６Ｇｙ Ｘ射线全身照射后 １６ｈ，及４Ｇｙ全身照射后 ０．５、 ２、 ４、 ８、 １６、 ２４、 ４８、 ７２ｈ，昆明小鼠胸腺及脾脏中 ＭＴ含量的变化。结果发现，在 ０．５～６Ｇｙ剂量范围内胸腺中 ＭＴ含量呈剂量依赖性增高，其中， ４Ｇｙ和 ６Ｇｙ组有统计学意义（ｐ＜０．０５）。 ４Ｇｙ Ｘ射线照射后 ８～４８ｈ胸腺中 ＭＴ含量显著增高（ｐ＜ ０．０５～ｐ＜０．００１）。然而，量效及时效研究均未见脾脏中 ＭＴ 含量的变化．以上结果表明，Ｘ射线能诱导ＭＴ在免疫器官中表达，但表现出明显的组织特异性。

不同剂量X射线全身照射对小鼠脾细胞周期进程的影响

采用流式细胞术研究了Ｘ射线全身照射后小鼠脾细胞周期的进程及其剂量效应关系。结果表明，７５ｍＧｙＸ射线全身照射后１２～７２ｈ脾细胞周期各时相细胞数目发生明显变化，Ｇ０／Ｇ１期细胞数低于假照组，Ｓ期细胞数增多，说明其ＤＮＡ合成能力增强，至７ｄ时回复至假照组水平；２．０Ｇｙ全身照射后８ｈ时脾细胞出现明显的Ｇ２阻滞，１２ｈ时Ｇ２阻滞和ＤＮＡ合成抑制达最高点，７２ｈ其细胞周期进程则明显加快，至７ｄ时回复至假照组水平。不同剂量全身照射后２４ｈ的结果表明，在低剂量范围内（５０～２００ｍＧｙ），５０、７５ｍＧｙ照后脾细胞的ＤＮＡ合成能力增强，尤以７５ｍＧｙ更明显，而１００、２００ｍＧｙ照后开始出现Ｇ１阻滞；高剂量（０．５～４．０Ｇｙ）照后则出现明显的ＤＮＡ合成抑制以及Ｇ１和Ｇ２阻滞。

小剂量辐射抑制肿瘤细胞播散的机理研究

观察了静脉注入肿瘤细胞前24h，75mGyX射线全身照射对小鼠免疫功能的影响。结果表明照射组小鼠胸腺S期细胞百分数于照射后4d，胸腺CD3+细胞百分数于照射后2、8d，脾细胞IL－2和γIFN分泌于照射后4d，脾脏NK细胞活性于照射后2、4、6和8d均较假照射组明显增高（P＜0．05～0．01）。提示小剂量辐射增强机体免疫功能可能与其抑制肿瘤细胞播散有关。

X射线诱导CREB活化及其与cAMP通路的关系

检测X射线全身照射对小鼠胸腺细胞内CREB的DNA结合活性的影响和cAMP/cGMP比值的变化 ,并探讨照射后CREB的活化与cAMP通路的关系。采用电泳移动变化分析及竞争性蛋白结合分析法分别检测了胸腺细胞内CREB的DNA结合活性和cAMP、cGMP含量的变化。结果表明 ,大剂量照射 (0 .5- 6 .0Gy)诱导CREB的DNA结合活性明显升高 ,2Gy照射后最显著 ;cAMP/cGMP比值也表现为剂量依赖性的显著增加。 0 .0 75Gy照射后 ,CREB的DNA结合活性短暂下降后轻度增强 ,cAMP/cGMP比值下降 ,2 4h达最低值。说明低水平辐射诱导的CREB活性短暂下降后的轻度增强 ,可能不通过cAMP通路 ;较高剂量X射线诱导的CREBDNA结合活性的明显增强 。

电离辐射对小鼠脾细胞IL-2Rα表达的影响

研究不同剂量、特别是低剂量辐射全身照射后，小鼠脾细胞IL－2Rα的变化规律，以揭示低剂量辐射免疫增强效应的发生机理。小鼠接受不同剂量X射线全身照射24h后，体外诱导腺细胞IL－2R的表达，采用直接免疫荧光流式细胞术检测脾细胞IL－2Rα表达的变化。结果50～500mGyX射线全身照射后24h，小鼠脾细胞IL-2Rα表达显著增高（p＜0．05），表现为CD25阳性细胞百分率明显高于假照射对照组，尤其以50mGy照射组表达最为明显（p＜0．01）。1．0～2．0Gy照射组，CD25阳性细胞百分率无明显变化（p＞0．05）。4．0～6．0Gy全身照射后，CD25阳性细胞百分率明显降低（分别为p＜0．05，p＜0．01）。以上结果提示：低剂量辐射可促进牌细胞IL－2R的表达，这对揭示低剂量辐射免疫增强效应的发生机理具有重要意义。较大剂量辐射全身照射的实验数据还表明：较大剂量辐射全身照射抑制脾细胞IL－2R的表达。

X射线全身照射对小鼠胸腺细胞CyclinB_1和p34^(cdc2)蛋白表达的影响

本文采用免疫组织化学法研究了低、高剂量 X射线全身照射后不同时间小鼠胸腺细胞 CyclinB1和 p34cdc2 蛋白表达的变化。结果表明 ,与假照组相比 ,75 m Gy X射线全身照射后 8h小鼠胸腺细胞Cyclin B1蛋白表达开始升高 ,12 h达高峰 ,4 8h恢复至正常水平 ;而 2 Gy照射后 4 h小鼠胸腺细胞Cyclin B1蛋白表达开始降低 ,12 h降至最低 ,2 4 h有回升趋势 ,4 8h恢复至假照水平。p34cdc2 蛋白的表达 ,与假照组相比 ,75 m Gy照射后 4～ 4 8h未见明显变化 ;而 2 Gy照射后的时程变化与相同剂量照射后 Cyclin B1蛋白表达的变化基本一致。提示 :低剂量 X射线全身照射可诱导小鼠胸腺细胞 Cyclin B1蛋白表达增强 ,从而促进细胞周期进程 ,但对 p34cdc2 表达无影响 ;相反 ,较高剂量照射导致 Cyclin B1和p34cdc2蛋白表达均下降 ,最终发生 G2 阻滞。

p53及其下游基因在电离辐射诱导小鼠胸腺细胞G_1期阻滞中的作用

采用流式细胞术和Northernblot检测了X射线全身照射后的昆明系小白鼠胸腺细胞的细胞周期、p53及其下游基因表达的变化。结果表明：（1）2GyX射线全身照射后4h，小鼠胸腺细胞G1期细胞百分数明显高于假照射组，24h达峰值；持续至照射后48h；（2）2Gy照射后p53蛋白表达在照射后1～8h明显增高，p21蛋白表达在照射后4～48h明显增高，而GADD45蛋白表达未见明显变化；（3）2GyX射线照射后小鼠胸腺细胞WAF1基因转录从照射后1h开始升高，照射后2h达峰值，持续至照射后24h，48h恢复至正常水平。照射后GADD45基因转录无明显变化。结果提示，2GyX射线全身照射可诱导小鼠胸腺细胞G1期阻滞，p53－WAF1通路在电离辐射诱导小鼠胸腺细胞G1期阻滞中起重要作用。

小剂量辐射增强化疗药物的抑瘤作用及其机制

在丝裂霉素Ｃ（ＭＭＣ）或环磷酰胺（ＣＰ）腹腔注射前６ｈ，给予荷有Ｌｅｗｉｓ肺癌的Ｃ５７ＢＬ／６小鼠７５ｍＧｙＸ射线全身照射（ＷＢＩ）。结果表明７５ｍＧｙＸ射线全身照射可增强化疗药物的抑瘤作用，肿瘤生长速度明显减慢。同时对与肿瘤免疫相关的某些免疫学指标进行了观察，发现７５ｍＧｙＸ射线全身照射可以促进荷瘤鼠的胸腺和脾细胞的增殖，促进自然杀伤细胞（ＮＫ）、淋巴因子激活的杀伤细胞（ＬＡＫ）和特异性杀伤性Ｔ细胞（ＣＴＬ）的杀伤功能，增加脾细胞白细胞介素Ｉ（ＩＬ－２）的分泌量，并且减低ＭＭＣ和ＣＰ对免疫功能的损害。

胸腺细胞成熟分化不同阶段的辐射敏感性

采用免疫荧光流式细胞术研究了胸腺细胞及其亚组的辐射效应。结果表明：胸腺细胞具有较高的辐射敏感性，并且在胸腺细胞成熟分化的不同阶段辐射敏感性不同。成熟的胸腺细胞具有相对的辐射抗性。各亚组辐射敏感性依次为：ＣＤ４＋ＣＤ８＋＞ＣＤ４－ＣＤ８－＞ＣＤ４－ＣＤ８＋＞ＣＤ４＋ＣＤ８－，Ｄ３７值分别为０．７６、０．９２、１．７７Ｇｙ和３．６７Ｇｙ。全胸腺细胞的Ｄ３７为０．８４Ｇｙ。ＣＤ３＋细胞的Ｄ３７值为２．０Ｇｙ。