海洋细菌假交替单胞菌DL-6来源β-N-乙酰己糖胺酶异源表达及酶学表征

从海洋细菌假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)DL-6中克隆β-N-乙酰己糖胺酶基因(PsHex),扩增至pET-28a(+),并成功在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达,经镍-次氮基三乙酸亲和层析纯化得到纯蛋白。结果表明:PsHex编码876个氨基酸,分子质量约99.46 kDa,理论等电点5.65,序列对比分析表明,Ps Hex属于糖苷水解酶GH20家族;Ps Hex蛋白最适温度30℃,最适pH 8.5,比活力11.30 U/mg,且在20℃、pH 7.5时稳定性最高;重组蛋白可降解琼脂、葡聚糖、可溶性淀粉、卡拉胶等多种底物;Na^(+)、Mg^(2+)、Fe^(3+)、K^(+)、Ca^(2+)、二硫苏糖醇、吐温-80、乙二胺四乙酸、β-巯基乙醇对酶有激活作用;Ps Hex以对硝基苯基-β-D-乙酰氨基葡萄糖苷为底物的米氏常数(K_(m))为2.523 mol/L、转化效率(K_(cat))为79.035 min^(-1)、最大反应速率(v_(max))为2.081 U/mg、K_(cat)/K_(m)=31.326。该研究为酶法降解几丁质产生N-乙酰葡萄糖胺的生产应用提供了理论参考。

p53基因敲除大鼠模型的构建及表型分析

使用TALEN技术制作p53基因敲除大鼠模型,建立种群并分析大鼠表型。设计特异性识别p53基因外显子2的TALEN蛋白并构建相应载体,将体外转录的TALEN m RNA注射SD大鼠受精卵,出生后从仔鼠中通过测序筛选靶位点正确剪切的阳性小鼠。结果显示,注射得到11只新生仔鼠,通过测序发现其中有10只靶位点发生剪切。选取其中4只作为首建鼠进行繁殖。p53基因敲除纯合子表现出肿瘤易发性,主要自发性肿瘤类型为恶性纤维组织肉瘤。此外,p53基因敲除纯合子大鼠表现出眼睛发育异常,视网膜变性及晶状体纤维排列紊乱。通过TALEN技术高效地获得了p53基因敲除大鼠模型,纯合子敲除大鼠除了易发肿瘤并伴有眼发育异常,因而该敲除大鼠模型除了可用于研究肿瘤发生机制外,也可用于研究p53基因在眼发育过程中的功能。

不同小鼠品系囊胚受体对C57BL/6胚胎干细胞种系嵌合效率的影响

目的考察不同品系的小鼠囊胚对C57BL/6胚胎干细胞种系嵌合效率的影响,进而提高通过在C57BL/6胚胎干细胞中同源重组制作基因打靶小鼠的效率。方法选取近交系B6(Cg)-Tyrc-2J和BALB/c品系及封闭群ICR作为囊胚供体鼠,通过在TLX3、Ai3K和SL三个不同基因修饰ES细胞的种系嵌合实验中,平行比较三者的囊胚利用率、嵌合鼠获得效率以及种系遗传效率等三个方面,并进一步针对囊胚来源这一因素对效率的影响进行统计学分析。结果三种ES细胞均未能通过B6(Cg)-Tyrc-2J品系囊胚的注射获得种系遗传。而BALB/c品系与ICR品系相比,囊胚利用率明显低于ICR品系(P<0.05);嵌合鼠获得效率方面,BALB/c与ICR相当(P=0.115);而种系遗传效率方面,BALB/c品系显著高于其他品系(P<0.01)。结论 BALB/c品系在C57BL/6胚胎干细胞种系嵌合效率方面确实具有优势,然而,由于BALB/c囊胚较难获得,并且存在发育延迟和透明带脆性高等问题,而ICR品系在囊胚获得和利用方面的效率明显高于BABL/c,并且也可以支持C57BL/6胚胎干细胞的种系遗传,因此也是C57BL/6胚胎干细胞囊胚注射中较好的选择。

获能培养液等因素对遗传工程小鼠冻融精子体外受精率的影响

目的探讨遗传工程小鼠精子冷冻、复苏及体外受精率的效果,建立简便、经济的遗传工程小鼠保种体系。方法采用精子冷冻、体外受精和胚胎移植技术,比较了精子获能培养液、雄鼠周龄及精子冻存液等因素对于遗传工程小鼠精子冷冻保存的影响。结果用CPA精子冻存液冷冻保存精子,精子复苏后用PM精子培养液获能培养,体外受精率在82.49%-91.43%,而HTF精子培养液的体外受精率为14.46%-27.38%,同品系间差异极显著（P〈0.01）;10-35周龄的雄鼠精子均能成功冷冻、受精,移植后产仔;使用R18S3,CPM,CPA三种不同精子冻存液冷冻遗传工程小鼠精子,复苏后采用PM精子培养液体外受精,受精率分别是75.85%、88.89%和94.27%,移植后得到阳性小鼠;体外受精后的胚胎成功冷冻保存,移植后产仔。结论采用CPA精子冻存液冷冻保存精子,精子复苏后用PM精子培养液体外受精,能够更有效地保存遗传工程小鼠。

印度农业科技创新与战略发展研究

印度拥有世界最大的农业研究系统,研究其未来农业科技发展愿景以及重点关注的领域,对于了解发展中国家的农业科技发展动向以及推动开展"一带一路"农业科技合作具有重要意义。本文介绍了印度农业科技发展的愿景,阐述了其科技创新的重点方向和关键技术领域,并从政策组织、教育与人力资源开发以及技术转让等方面探究了创新举措。最后,对印度农业科技创新路径进行总结,指出了对中国的借鉴意义。

基于稳定表达萤火虫荧光素酶Vero细胞系体外病毒中和活性检测方法的建立及应用

目的建立一种基于稳定表达萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,fluc)Vero细胞系的高通量检测方法,以评估样品的体外抗病毒中和活性。方法基于成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/Cas9靶向基因编辑技术,构建一种稳定表达fluc的Vero细胞系,在此基础上建立痘病毒和呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染细胞活性检测方法,利用该方法评估痘病毒免疫血清及RSV单抗的中和活性,并与噬斑抑制法及细胞活力检测(adenosine triphosphate,ATP)法检测结果进行比较。结果成功构建了Vero-fluc细胞系,其细胞量与表达的fluc相关性良好(R^(2)=0.9948)。利用Vero-fluc细胞作为感染细胞验证的痘病毒中和活性检测方法具有良好的稳定性、可靠性[信噪比(signal/background ratio,S/B)=25],可满足高通量的检测需求(Z’=0.9),相比传统噬斑抑制法一致性强(R2=0.76),免疫血清的ID50值较噬斑法平均高出2倍。建立的RSV中和活性检测方法,检测的抗RSV单抗中和活性与ATP活性试剂盒检测结果一致,Vero-fluc细胞法在1∶103~1∶105的抗体滴度水平上抑制率显著高于ATP法。结论建立的基于Vero-fluc细胞系的病毒中和活性检测方法与传统方法相比,具有良好的相关性,结果可靠,且具有更高的灵敏度及检测通量,是一种通用型体外抗病毒中和活性评价方法。

提高利用C57BL/6胚胎干细胞系制作基因打靶小鼠效率的研究

为了提高通过C57BL/6（B6）胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES cells）获得基因打靶小鼠的效率,该研究利用经过体外和体内多能性验证的C57BL/6 ES细胞系B6-1-6,开展了37组平行的制作基因打靶小鼠的实验。首先,对不同的囊胚获取的方式进行对比;其次,统计37组实验中的嵌合鼠表观嵌合度与种系遗传效率,并对二者相关性进行分析。对于BALB/c小鼠,自然排卵相较于激素超排能够得到更多囊胚（2.91个囊胚/只vs 0.82个囊胚/只）;对于最佳注射个数的探索,利用C57BL/6 ES细胞系B6-1-6进行基因修饰并注射囊胚,注射65-97个胚胎获得阳性打靶动物的可能性为95%;嵌合鼠毛色嵌合率与种系遗传率有一定相关性（r=0.316,P=0.057）,而嵌合鼠眼睛颜色与种系遗传效率显著正相关（r=0.328,P〈0.05）。该研究探索了用于C57BL/6 ES细胞注射的BALB/c囊胚获取方式的优化和最佳的注射数量,以及嵌合鼠表观嵌合度与种系遗传效率相关性等方面,以期为相关的研究提供有益的参考。