分子生物学检验教学中PBL教学法的应用探讨

作为卫生检验与检疫专业主干课程的分子生物学检验,其课程内容覆盖广、应用性强,其教学具有很强的操作性和技术性.单纯依靠传统课堂理论课讲授,容易让学生产生消极学习的态度.而"以问题为导向"的PBL教学模式,因其教育理念、教学方法和能力培养效果等方面具有优势,使其在教育教学中不断得到青睐和应用.就PBL教学模式在卫生检验与检疫专业的分子生物学检验教学应用中做一些初探,以期为提高该专业课程的教学质量提供参考.

基于线粒体COI基因5′端区段粉螨DNA条形码研究

目的:基于线粒体COI基因5′端区段对常见储藏物粉螨进行分子鉴定,为粉螨鉴定方法的探讨提供依据。方法:采集储藏物样本,分离粉螨,形态学鉴定后,提取单个螨基因组DNA、PCR扩增、克隆测序,所获序列在Blast中进行同源性比对。结合GenBank已知粉螨COI基因序列,用ClustalX 1.83软件进行多序列比对,基于MEGA X软件进行序列分析并计算遗传距离,构建Maximum Likelihood系统发育树。结果:经形态学鉴定出7种粉螨,其中腐食酪螨Tyrophagus putrescentiae、范张食酪螨T.fanetzhangorum、粉尘螨Dermatophagoides farinae、棕脊足螨Gohieria fusca和害嗜鳞螨Lepidoglyphus destructor分子鉴定与形态学鉴定相一致,拱殖嗜渣螨Chortoglyphus arcuatus和纳氏皱皮螨Suidasia nesbitti分子鉴定与形态学鉴定并非一致,共检测到261个变异位点,400个保守位点,247个简约信息位点。种内遗传距离为0.00~0.01,种间遗传距离为0.171~0.262。构建ML系统进化树显示,7种粉螨均独立聚为一支,且支持率均达100%,与形态学鉴定一致。结论:线粒体COI基因5′端区段可用于7种常见储藏物粉螨的物种鉴定,为构建DNA条形码数据库提供基础资料。

变应原体外检测技术研究进展

变应原的准确检测对过敏性疾病的预防和诊疗至关重要。体外检测是当前变应原检测的主要研究方向。本文主要对检测血清sIgE的放射变应原吸附试验、酶联免疫吸附试验、荧光酶免疫分析、纳米磁微粒化学发光法、免疫印迹法、液相芯片法,以及直接检测变应原的生物共振法进行了概述,并对各种体外检测技术的优缺点进行了比较,以期为临床上选择合适的变应原体外检测方法提供参考。

基于高通量测序的粉尘螨体内细菌多样性研究

目的探讨粉尘螨(Dermatophagoides farinae)体内细菌多样性。方法取实验室人工饲养的粉尘螨,采用Illumina PE250高通量测序平台扩增测序细菌16S核糖体RNA(16S ribosomal RNA,16S rRNA)基因V4区,获得的原始序列经质控过滤后得到有效序列。采用Usearch软件、Silva数据库、Mothur软件对有效序列进行操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)聚类并分析细菌群落组成与alpha多样性指数。结果共获得187616条有效序列,根据序列相似性>97%进行聚类,得到469个OTUs。OTU注释结果表明,粉尘螨体内细菌分属于26个门、43个纲、100个目、167个科、284个属。在门分类阶元水平,粉尘螨体内细菌主要注释到变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和酸杆菌门,其中变形菌门为优势菌门;在属分类阶元水平,罗尔斯通氏菌属、立克次体目未确定属、葡萄球菌属和鞘氨醇单胞菌属为优势菌属。在非优势菌属中,发现沃尔巴克氏体。结论粉尘螨体内细菌群落组成具有较高多样性,个体间细菌群落多样性与丰度存在差异。

范张食酪螨和腐食酪螨的形态学与分子生物学鉴定

目的对范张食酪螨与腐食酪螨进行形态学和分子生物学鉴定。方法采集房舍和储藏物样本,从样本中挑取单个成螨,进行纯培养。从培养标本中挑取成螨制成玻片标本。根据无气门亚目螨类检索表,进行形态学鉴定。然后,提取单只螨基因组DNA,通过PCR扩增、测序获得线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因(COⅠ)序列;将所获序列在美国国立生物技术信息中心中用BLAST进行同源性比对。使用ClustalⅩ1.83软件对2种螨的COⅠ序列进行比对,基于MEGAⅩ软件进行序列分析,并以最大似然法构建系统发育树。结果范张食酪螨足Ⅱ基节板后缘1/3处明显向内凹陷,下缘曲线近似“S”形,足Ⅰ跗节感棒ω1在远端2/3处明显增宽;而腐食酪螨足Ⅱ基节板呈三角形,下缘平直或略凹,足Ⅰ跗节感棒ω1在远端1/4处增宽。所测得的范张食酪螨和腐食酪螨COⅠ基因序列经BLAST比对显示,分别与GenBank中收录的范张食酪螨和腐食酪螨COⅠ基因序列相似性在99.00%以上。基于COⅠ基因构建的最大似然法系统进化树显示,范张食酪螨和腐食酪螨均独立聚为一支,且支持率均达100%。结论范张食酪螨和腐食酪螨既可以利用外部特征进行形态学鉴定,也可以基于COⅠ基因进行分子生物学鉴定;形态学和分子生物学鉴定方法相结合,可以提高螨类近缘种鉴定的准确性。

基于18S和28S rDNA基因的房舍甲螨DNA条形码比较研究

目的比较18S和28S rDNA基因应用于房舍甲螨物种鉴定的有效性及适用性。方法2021年2—10月在安徽省部分地区(亳州、阜阳、淮南、滁州、合肥、芜湖、铜陵、安庆和黄山等9市)的居室、农舍及仓储等房舍采集灰尘并分离甲螨,利用形态学特征鉴定螨种,提取单只甲螨基因组DNA,PCR扩增甲螨18S rDNA,28S rDNA D3和D8基因片段并测序。从GenBank下载房舍甲螨基因序列,用MEGA X软件进行序列特征分析和遗传距离计算,并通过ABGD网站进行DNA条形码间隙分析。采用邻接法构建甲螨的系统进化树。结果共采集甲螨53只,经形态学鉴定属于3科5属5种,分别为滑菌甲螨(15只)、盛若甲螨(9只)、新小奥甲螨(10只)、棒梳枝奥甲螨(10只)和间新美奥甲螨(9只)。从该5种甲螨扩增获得18S rDNA、28S rDNA D3和D8基因单倍型分别为7、5和11条;从GenBank中共下载房舍甲螨序列42条。序列分析结果显示,18S rDNA、28S rDNA D3和D8基因长度分别为442~590、247~331、270~283 bp,GC含量分别为45.6%、52.2%和57.5%,变异率分别为17.6%、21.4%和21.7%。18S rDNA、28S rDNA D3和D8基因种内遗传距离平均值分别为0.001、0.001和0.005,种间遗传距离平均值分别为0.064、0.115和0.109,种间遗传距离平均值均大于种内遗传距离平均值(10倍以上)。DNA条形码间隙分析结果显示,18S rDNA和28S rDNA D3基因种内和种间遗传距离存在重叠区,28S rDNA D8基因则存在明显DNA条形码间隙。系统进化树分析结果显示,房舍甲螨科属分类阶元聚类结果与形态学聚类结果一致,金黄缝甲螨和淡红缝甲螨在18S rDNA基因系统进化树显示聚集在一起,无法分开;28S rDNA D3基因系统进化树呈现出交叉类聚。结论18S rDNA、28S rDNA D3和D8基因能够有效地用于房舍甲螨的物种鉴定,28S rDNA D8基因适合于低分类阶元螨种的鉴定,18S rDNA和28S rDNA D3基因适合于高阶元螨种。