溶酶体膜蛋白sidt2介导肝脏细胞的凋亡:不通过抑制自噬溶酶体途径

目的研究溶酶体膜蛋白Sidt2敲除后在肝脏细胞中调控凋亡的途径。方法利用Crispr-Cas9技术构建Sidt2敲除的人肝脏(HL7702)细胞模型,检测Sidt2和自噬关键蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白水平,MDC染色观察自噬体形成情况,通过EdU和流式细胞实验观察Sidt2对肝脏细胞增殖活性和凋亡的影响,并且使用0、10、25、50、100、200μmol/L的氯喹(CQ)摸索肝脏细胞CQ饱和浓度,检测对其自噬流的影响,以及使用CQ进一步探索影响肝脏细胞的增殖活性其凋亡水平的机制。结果成功构建HL7702细胞Sidt2+/+组及Sidt2-/-组。Sidt2基因缺失可导致肝脏细胞增殖被抑制和凋亡水平的增加,自噬关键蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ和P62在蛋白水平上的表达均增加且自噬体含量增加(P<0.05)。结果显示50μmol/LCQ作用下肝脏细胞自噬达到饱和状态,50μmol/L CQ使Sidt2基因缺失时LC3B和P62的表达均增加(P<0.05),且CQ进一步降低肝脏细胞活性,并促进其凋亡水平(P<0.05)。结论在离体水平上,Sidt2基因剔除后,HL7702细胞可表现自噬通路的异常,并且不通过抑制自噬溶酶体途径介导和调控凋亡。

溶酶体膜蛋白Sidt2缺失导致肝脏细胞自噬受损

目的研究溶酶体膜蛋白Sidt2缺失后对肝脏自噬的影响。方法利用Crispr-Cas9技术构建Sidt2敲除的人肝脏(HL7702)细胞模型,对自噬关键蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、P62及自噬相关蛋白Atg5、Atg7、Atg12进行蛋白水平检测,同时使用免疫荧光方法对LC3B及P62进行共定位,检测自噬小体对P62货物蛋白的识别与封存以及自噬溶酶体的降解。对LC3B及LAMP1进行免疫荧光共定位,检测自噬小体与溶酶体融合过程。使用LysoTracker对酸性溶酶体进行示踪。结果成功构建HL7702细胞Sidt2^(+/+)组及Sidt2^(-/-)组,HL7702细胞Sidt2^(-/-)组较Sidt2^(+/+)组相比,自噬关键蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ及P62表达均增多(P<0.01),免疫荧光结果显示LC3B及P62亦明显增多(P<0.001),同时自噬相关蛋白Atg5、Atg7、Atg12表达减少(P<0.05)。LC3B与P62共定位降低,LC3B与LAMP1共定位降低,酸性溶酶体数量减少(P<0.05)。结论Sidt2基因的缺失导致人肝脏细胞自噬小体对P62货物蛋白的识别和封存障碍,同时酸性溶酶体数量减少、自噬小体与溶酶体融合障碍导致自噬溶酶体途径受阻,最终导致LC3B与P62发生堆积,肝脏细胞自噬受损。

以CXCL1为关键靶点的糖尿病肾病差异基因分析及潜在药物预测

目的通过蛋白微阵列筛选糖尿病肾病模型中高表达的炎症因子,利用生物信息学分析差异性基因及其调控网络,并预测可能具有治疗作用的小分子化合物。方法利用炎症因子芯片筛选糖尿病肾病细胞模型和动物模型中具有相同趋势的炎症因子。通过基因本体论(Gene Ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析R语言所筛选的差异性基因。STRING在线构建蛋白互作网络,Cytoscape软件解析核心子网络,Connectivity Map寻找预测小分子化合物。结果16周db/db小鼠和高糖刺激的系膜细胞被确定为糖尿病肾病的模型,其中趋化因子(C-X-C基序)配体1(C-X-C motif chemokine ligand 1,CXCL1)的表达在两模型中均有升高。多个GEO数据芯片均显示CXCL1的高表达与糖尿病肾病有明显关联。其中GSE30122包括30个基因的上调和23个的下调。GO富集分析集中在体液免疫和脂多糖反应等生物过程;而KEGG富集主要在百日咳和凝血级联通路。CytoHubba识别了10个中枢基因,例如ALB、LUM和CXCL1等。此外,使用Connectivity Map预测了10种小分子化合物作为潜在的治疗药物。结论CXCL1可能是糖尿病肾病发生发展的关键基因,ALB、LUM、CXCL1、MMP7、TGFBI、CCL2、S100A4、SOX9、VCAN和CLU可能参与以CXCL1为中心的调控网络,有10种小分子化合物可能作为潜在的治疗药物。