莫诺苷通过抗氧化应激保护雷公藤甲素所致肝细胞凋亡

目的观察具有抗氧化应激活性的环烯醚萜苷化合物莫诺苷对雷公藤甲素(TP)诱导的肝损伤的保护作用及其分子机制。方法雷公藤甲素,莫诺苷分别单独及联合给药小鼠及人肝癌HepG2细胞后,血清学法测定各组小鼠肝生化指标的变化;MTT法检测各实验组对HepG2细胞生长抑制率的影响;激光共聚焦显微镜观察各组细胞形态的变化;流式细胞术检测各组细胞凋亡率;WB法检测氧化应激通路中关键蛋白的表达。结果动物实验表明雷公藤甲素具有很明显的肝脏损伤作用,小鼠血清中肝生化指标及肝脏指数的水平显著升高(P<0.05);细胞实验则表明其抑制了HepG2细胞的生长,24 h细胞的生长活性仅为72.83%,并随时间增长而降低。细胞凋亡明显,细胞核破裂皱缩,24 h细胞凋亡率高达43.1%。此外,氧化应激通路相关蛋白Nrf2,HO-1的表达明显降低。而莫诺苷联合用药后逆转了以上实验指标,使得小鼠中肝生化指标及肝脏指数显著下降(P<0.05),肝细胞的凋亡率,细胞形态及氧化应激相关通路蛋白的表达都得到了明显改善(P<0.05)。结论莫诺苷可保护雷公藤甲素诱导的肝损伤,其机制可能与抗氧化应激有关。

牛蒡子苷通过抑制炎症通路降低雷公藤甲素所致肾毒性

目的探讨具有抗炎活性的牛蒡子苷对雷公藤甲素(TP)所致的大鼠肾毒性的保护作用和潜在机制。方法将40只SD大鼠随机分为4组:对照组(不含药液的PBS),牛蒡子苷组(500 mg·kg^-1·d^-1),雷公藤甲素组(500μg·kg^-1·d^-1),联合用药组(牛蒡子苷500 mg·kg^-1·d^-1+雷公藤甲素500μg·kg^-1·d^-1)。分别予以相应处理后,采血测定肾脏生化指标,取肾脏测定肾脏指数并用HE染色观察其组织病理学变化。进一步体外培养人肾小管上皮细胞(HK-2细胞),MTT法检测细胞的存活率变化,激光共聚焦显微镜记录各组细胞的形态变化,流式细胞术测定细胞凋亡率改变,Western blot法检测炎症相关通路蛋白表达变化。结果在体内实验中,牛蒡子苷显著降低了TP所致的大鼠血清尿素氮(BUN),肌酐(Scr)等肾脏生化指标和肾脏指数(P<0.05)。此外,牛蒡子苷明显改善了TP所致的肾细胞的水肿,空泡化和点状坏死等组织病理学改变。在体外实验中,牛蒡子苷抑制了TP诱导的HK-2细胞毒性,24 h细胞存活率明显升高(P<0.05);改善了凋亡的细胞形态,细胞凋亡率显著下降(P<0.05);逆转了炎性通路中IκBα和Nuclear p65蛋白表达(P<0.05)。结论牛蒡子苷可以减轻雷公藤甲素所致的肾损害,其机制可能与其抗炎活性有关。

拟康氏木霉胞外多糖联合奥沙利铂可体外协同抑制结直肠癌细胞的增殖

目的探讨拟康氏木霉胞外多糖(EPS)联合奥沙利铂(Oxa)用药对结肠癌细胞HCT116的协同抑制作用。方法实验分为Control组(0μg/mL)、Oxa组(8μg/mL Oxa)、EPS组(100μg/mL EPS)、EPS+Oxa组(8μg/mL Oxa+100μg/mL EPS)。CCK-8检测细胞活力,CompuSyn软件拟合Fa-CI曲线评价联用效果。流式检测凋亡和周期、划痕实验和transwell实验检测细胞迁移能力,Oxa和EPS相关基因与结直肠癌相关基因取交集进行PPI分析以及GO和KEGG富集分析。结果Oxa单用或与EPS联用处理HCT116细胞,均可使HCT116细胞活力受到抑制,并呈现剂量与时间依耐性,两者联用有明显的协同作用(CI<1)。两药联用组的细胞总凋亡率与Oxa组以及对照组比较均显著升高(P<0.05);联合用药组处于S期的比例高于其他各组。EPS和Oxa均具有抑制HCT116细胞迁移的作用,两者联用后抑制作用更为明显。KEGG分析显示主要涉及耐药、凋亡、血管新生等通路。结论EPS联合奥沙利铂可协同抑制HCT116细胞增殖,促进该细胞凋亡和细胞S周期阻滞、抑制细胞迁移,铂耐药、PI3K-Akt、MAPK等信号通路发挥了关键作用。

杜鹃花总黄酮对急性脑缺血/再灌注损伤大鼠STIM-Orai调控的G蛋白偶联SOCE通路的影响

目的探究杜鹃花总黄酮(TFR)对急性脑缺血/再灌注损伤大鼠STIM-Orai调控的G蛋白偶联钙库操作性Ca2+内流(SOCE)通路的影响。方法将SD大鼠随机分为假手术(Sham)组、模型(MCAO)组、TFR组、TFR+2-氨基乙基联苯基硼酸酯(2-APB)组、2-APB组,每组各8只。ELISA检测大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α的活性;HE染色检测大鼠缺血脑组织的病理变化;TTC染色观察大鼠脑组织梗死情况;Western blot和RT-qPCR分别检测脑组织STIM1、STIM2、Orai1、caspase-3、PKB的蛋白及mRNA表达水平。结果TFR组大鼠神经功能评分相较于MCAO组明显降低,脑组织病理损伤明显改善,梗死率明显降低,血清中IL-1、IL-6、TNF-α的活性明显降低,脑组织中STIM1、STIM2、Orai1、caspase-3蛋白及mRNA表达明显下调,PKB明显上调,而加入SOCE通道抑制剂后,以上作用进一步加强。结论TFR可减轻MCAO大鼠脑损伤,机制可能与其抑制脑组织SOCE通路,降低炎症介质活性,减少Ca^(2+)超载和细胞凋亡等有关。

藁本内酯通过抑制铁死亡减轻PC12细胞OGD/R损伤的分子机制研究

该研究旨在从铁死亡角度探讨中药当归挥发油主要活性成分藁本内酯减轻PC12细胞氧糖剥夺再灌注(oxygenglucose deprivation/reperfusion,OGD/R)损伤的分子机制。体外构建OGD/R模型,于再灌注时加入藁本内酯12 h后,采用CCK-8法检测PC12细胞活力;DCFH-DA免疫荧光染色法分析细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平变化;Western blot法检测铁死亡相关蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、转铁蛋白受体1(transferrin receptor 1,TFR1)、溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)以及铁自噬相关蛋白核受体共激活因子4(nuclear receptor coactivator 4,NCOA4)、铁蛋白重链1(ferritin heavy chain 1,FTH1)、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)的表达水平;细胞免疫荧光染色法分析LC3蛋白的荧光强度;化学发光法检测还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和铁(Fe)的含量;过表达NCOA4基因观察藁本内酯对铁死亡的作用。结果显示,与OGD/R组相比,藁本内酯可显著提高OGD/R损伤的PC12细胞活力,抑制ROS释放,降低Fe、MDA含量以及TFR1、NCOA4、LC3的表达水平,提高GSH含量以及GPX4、SLC7A11、FTH1的表达水平。过表达铁自噬关键蛋白NCOA4后,藁本内酯抑制铁死亡的作用部分被抵消,表明藁本内酯可能通过阻断铁自噬过程进而抑制铁死亡,最终发挥减轻PC12细胞OGD/R损伤的作用。该实验初步证明藁本内酯减轻PC12细胞OGD/R损伤的作用机制可能与其抑制铁自噬参与的铁死亡过程有关。

映山红花总黄酮减轻缺血性脑损伤的作用机制

研究映山红花总黄酮(total flavonoids of Rhododendra simsii,TFR)对大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型大鼠脑损伤和PC12细胞氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)损伤的作用,并探讨其潜在的作用机制。采用MCAO法建立大鼠局灶性缺血脑损伤模型,将雄性SD大鼠随机分成假手术组、模型组、TFR用药组,MCAO处理后连续用药TFR(60 mg·kg^(-1))3 d。ELISA检测血清中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的含量;HE和TTC染色法分别观察脑组织的病理变化和脑梗死情况;RT-qPCR和Western blot分别检测脑组织中钙释放激活钙通道调节分子1(calcium release-activated calcium channel modulator 1,ORAI1)、基质相互作用分子1(stromal interaction molecule 1,STIM1)、基质相互作用分子2(STIM2)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,caspase-3)mRNA水平及蛋白含量。建立PC12细胞OGD/R损伤模型,随机分为正常组、模型组、基因沉默组、TFR(30μg·mL^(-1))组、TFR(30μg·mL^(-1))+基因过表达质粒组。运用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪分别检测PC12细胞内Ca^(2+)浓度和细胞凋亡率;基因沉默和基因过表达技术观察STIM-ORAI调控的钙库操纵性钙内流(store-operated calcium entry,SOCE)通路对TFR作用的影响。结果显示,TFR连续用药3 d后可显著减轻MCAO大鼠脑组织病理学损伤,降低血清中TNF-α、IL-1、IL-6的含量,下调MCAO大鼠脑组织中ORAI1、STIM1、STIM2、caspase-3基因表达水平,上调PKB基因表达;TFR可显著降低OGD/R诱导的PC12细胞内Ca^(2+)超载和细胞凋亡。而沉默ORAI1、STIM1、STIM2基因可产生类似TFR的作用。过表达这些基因,可以显著阻断TFR降低PC12细胞Ca^(2+)超载和凋亡的作用。结果表明,在局灶性脑缺血再灌注损伤早期和OGD/R诱导的PC12细胞损伤中,TFR减轻缺血性脑损伤的作用可能与其抑制STIM-ORAI调控的SOCE通路,降低Ca^(2+)超载,减少炎症因子表达和细胞凋亡有关。

甲氨蝶呤合并山竹对佐剂关节炎大鼠的保护作用

目的研究甲氨蝶呤与山竹联合用药对佐剂关节炎(RA)大鼠急性期炎症的保护作用。方法建立佐剂关节炎大鼠模型。按照体重将大鼠随机分为5组:正常组、模型组、山竹组(1 g·kg_(-1))、甲氨蝶呤组(1 mg·kg_(-1))和联合组,每组10只。灌胃给药,1次/天,连续给药28 d。用酶联免疫吸附法测定血清中白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)的水平。结果给药28 d后,正常组、模型组、山竹组、甲氨蝶呤组和联合组的IL-1β水平分别为(21. 8±0. 7),(97. 1±2. 7),(55. 5±1. 2),(66. 9±1. 5)和(37. 1±1. 7)pg·m L_(-1);这5组的IL-6的水平分别为(33. 5±1. 0),(120. 9±4. 3),(48. 9±1. 1),(59. 3±1. 6)和(37. 5±1. 5) pg·m L_(-1)。模型组与正常组相比,或者山竹组、甲氨蝶呤组和联合组与模型组相比,差异均有统计学意义(均P <0. 05)。结论甲氨蝶呤和山竹的活性成分在RA大鼠炎症急性期及关节保护作用上可能具有互补的药理活性。

杜鹃花总黄酮通过SOCE通路减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的作用

探究杜鹃花总黄酮(total flavonoids of Rhododendron simsii,TFR)减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)的保护作用及其与钙离子传感器基质相互作用分子(stromal interaction molecule,STIM)和钙释放激活钙通道调节分子(calcium release-activated calcium modulator,Orai)调控的钙库操作性钙离子内流(store-operated calcium entry,SOCE)通路之间的关系。大鼠随机分为假手术(sham)组、模型(MCAO)组、TFR(60 mg·kg^(-1))组、TFR(60 mg·kg^(-1))+SOCE通路阻断剂2-氨基乙基联苯基硼酸酯(2-aminoethoxydiphenyl borate,2-APB)(2.5 mg·kg^(-1))组、2-APB(2.5 mg·kg^(-1))组。sham组、MCAO组大鼠给予生理盐水,用药组给予TFR(60 mg·kg^(-1)),连续灌胃14 d直至取材,SOCE通道阻断剂2-APB(2.5 mg·kg^(-1))术后给予腹腔注射。ELISA法检测大鼠血清中白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的活性;TTC染色检测大鼠的脑组织梗死情况;HE染色检测大鼠缺血脑组织的病理状况;Western blot和RT-qPCR技术分别检测脑组织STIM1、STIM2、Orai1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,caspase-3)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)的蛋白及mRNA表达水平;免疫荧光检测大鼠脑神经元的生长情况。结果显示,相较于MCAO组TFR组大鼠神经功能评分明显降低,脑组织病理损伤显著改善,梗死面积明显减少,血清中IL-1、IL-6、TNF-α的活性显著降低,脑组织中STIM1、STIM2、Orai1、PKB蛋白及mRNA表达显著上调,caspase-3表达显著下调,在荧光显微镜下可观察到双标阳性细胞增多;而加入2-APB后,以上作用明显减弱。综上结果表明,TFR可能通过上调SOCE通道相关信号分子的基因表达,诱导缺血区周边的神经发生,改善缺血区周边的神经元生存状态,抑制炎症因子活性,从而发挥对抗局灶性脑缺血再灌注损伤的作用。