肠道病毒71型3C蛋白酶原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的原核表达肠道病毒71型3C蛋白酶(enterovirus 713C protease,EV71-3Cpro)并制备其特异性多克隆抗体。方法首先依据密码子优化原则合成EV71-3Cpro基因,将其克隆到pET-28a表达载体NdeⅠ和XhoⅠ位点间构建重组质粒,再以冷CaCl 2法将其转化到大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中,优化原核表达条件。以HisTrap TM亲和层析柱进行分离纯化,以纯化的EV71-3Cpro作为抗原免疫大鼠,分离血清后以酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、蛋白质印迹法(western blotting,WB)鉴定多克隆抗体的效价及其特异性。结果ELISA和WB结果显示制备的大鼠抗EV71-3Cpro多克隆抗体效价达1∶1024000,且具有较好的特异性。结论抗EV71-3Cpro多克隆抗体的成功制备为EV71-3Cpro生物学功能的研究及其联合疫苗的开发奠定了实验基础。

新型冠状病毒奥密克戎变异株主蛋白酶的制备及其抑制剂的高通量筛选

目的基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)原理,建立奥密克戎变异株主蛋白酶(Omicron variant main protease,OM-Mpro)抑制剂高通量筛选模型,筛选新型OM-Mpro抑制剂。方法利用大肠杆菌进行OM-Mpro原核表达,再以HisTrap^(TM)亲和层析柱进行分离纯化。以FRET法进行OM-Mpro与野生型新型冠状病毒主蛋白酶(wild-type main protease,WT-Mpro)的酶活性测定并评价奈玛特韦的酶抑制活性。利用OM-Mpro抑制剂FRET高通量筛选模型对上市药物库进行高通量筛选。结果利用大肠杆菌成功进行了OM-Mpro原核表达与分离纯化,其与WTMpro酶活性无显著差异。奈玛特韦对OM-Mpro和WT-Mpro具有等同的酶抑制活性,说明奈玛特韦对奥密克戎变异株依然有效。通过对上市药物库进行高通量筛选,发现西吡氯铵是混合型OM-Mpro抑制剂,其半数抑制浓度值为8.76μmol·L^(-1)。结论成功制备了高活性OM-Mpro并建立了OM-Mpro抑制剂FRET高通量筛选模型,初步证实了西吡氯铵是混合型OM-Mpro抑制剂,为广谱抗冠状病毒药物先导化合物的筛选与发现奠定了基础。

重组泛素样特异性蛋白酶1在大肠杆菌中的表达条件优化与分离纯化

目的确定重组泛素样特异性蛋白酶1(ubiquitin-like specific protease 1,Ulp1)在大肠杆菌中的最佳表达条件并进行分离纯化。方法采用DNA重组技术,构建重组质粒Ulp1-pET-28a,并转化到Escherichia coli BL21(DE3)细胞中,以IPTG诱导Ulp1原核表达,并从诱导时间、诱导温度和IPTG诱导浓度方面确定其最佳表达条件,再以亲和层析法分离纯化Ulp1。结果SDS-PAGE分析表明,工程菌诱导温度为30℃、诱导时间为6 h、IPTG浓度为0.2 mmol/L时Ulp1表达量最高,表达量约为350 mg/L且成功进行了Ulp1的分离纯化。结论本研究成功进行了Ulp1原核表达条件的优化与分离纯化,为Ulp1在生物工程中的酶切应用奠定了实验基础。

大鼠抗人β-catenin多克隆抗体的制备与鉴定

目的:原核表达和分离纯化人β-catenin(138-781 aa)蛋白并制备特异性大鼠抗人β-catenin多克隆抗体。方法:利用PCR扩增β-catenin基因片段并克隆至pET-30a(+)表达载体构建重组质粒。将重组质粒转化到大肠杆菌Escherichia coli Rosetta(DE3)中,经原核表达优化后,诱导β-catenin蛋白表达,以SDS-PAGE和Western blot实验进行鉴定。采用亲和层析方法分离纯化β-catenin蛋白,以荧光偏振实验进行生物学活性鉴定。用β-catenin蛋白为抗原免疫大鼠制备多克隆抗体,随后采用ELISA和Western blot实验检测多克隆抗体的效价和抗原特异性。结果:成功进行了β-catenin蛋白的原核表达与分离纯化。荧光偏振实验表明纯化的β-catenin蛋白具有良好的生物学活性。ELISA实验表明抗人β-catenin多克隆抗体效价可达1∶128 000。Western blot实验证实抗人β-catenin多克隆抗体具有良好的抗原特异性。结论:成功进行了大鼠抗人β-catenin多克隆抗体的制备与鉴定,为深入研究β-catenin的生物学功能奠定了实验基础。

重组人HER3胞外域Ⅰ区183-227aa的原核表达及大鼠多克隆抗体的制备与鉴定

目的原核表达、纯化由人表皮生长因子受体3(HER3)183-227aa肽段(HER3Ⅰ)和麻疹病毒蛋白288-302aa肽段(MVF)融合构建的重组肽(MVF-HER3Ⅰ),并制备其多克隆抗体。方法将MVF与HER3Ⅰ融合构建重组肽MVF-HER3Ⅰ,用化学合成法合成重组肽基因,并将其与pET21b质粒和含有硫氧还蛋白(Trx)基因的pET32a质粒连接构建重组肽表达质粒,重组质粒用双酶切法鉴定。将重组质粒导入到大肠杆菌BL21(DE3)并进行表达参数优化及诱导表达。融合蛋白依次经镍离子亲和层析、肠激酶酶切和再次镍离子亲和层析制备重组肽。表达和纯化过程中的样品纯度和相对分子质量用SDS-PAGE分析。以纯化的重组肽为抗原免疫大鼠制备多克隆抗体。用ELISA法测定抗重组肽多克隆抗体效价,免疫印迹和免疫沉淀法分析抗重组肽多克隆抗体对重组肽和非变性状态HER3的识别,激光共聚焦法分析抗重组肽多克隆抗体与MCF7细胞的结合,磺酰罗丹明B染色法测定在有无神经调节素刺激下抗重组肽多克隆抗体对高表达HER3的MCF7细胞的增殖抑制作用。结果成功构建了重组肽的两种表达质粒,重组肽基因不能单独表达,但和Trx融合后可在37℃、0.2 mmol/L IPTG条件下呈可溶高表达。融合蛋白经亲和层析、酶切和再次亲和层析后得到重组肽。重组肽可刺激大鼠产生效价达1:512000的抗重组肽多克隆抗体。该抗体不仅可特异性识别重组肽,还可特异性沉淀非变性HER3和结合于MCF7细胞的细胞膜。不管有无神经调节素刺激,该抗体均呈浓度依赖性地抑制HER3高表达的MCF7细胞的增殖(P<0.01)。结论成功进行了重组肽MVF-HER3Ⅰ的原核表达和纯化,制备并鉴定了抗MVF-HER3Ⅰ多克隆抗体,为在体内外深入研究该抗体对HER3信号通路的影响打下基础。

重组人β-catenin原核表达条件的优化及生物学活性鉴定

优化重组人β-catenin(138~686 aa)在大肠埃希菌中的原核表达条件,经分离纯化后进行生物学活性鉴定。利用基因工程技术,将构建的重组质粒β-catenin-pET-30a(+)转化到Escherichia coli Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导后进行β-catenin原核表达。为了提高β-catenin表达量,从诱导时间、诱导温度与IPTG诱导浓度3个单因素方面进行原核表达条件优化。β-catenin经HisTrap层析柱分离纯化后,以荧光偏振实验和酶联免疫吸附测定实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)进行生物学活性鉴定。构建的工程菌经原核表达条件优化后,确定诱导温度25℃、诱导时间10 h、0.2 mmol/L IPTG作为β-catenin最佳原核表达条件。荧光偏振实验和ELISA实验说明,纯化的β-catenin具有良好的生物学活性。本研究成功进行了重组人β-catenin原核表达条件的优化与生物学活性鉴定,为深入研究β-catenin在肿瘤免疫抵抗中的生物学功能奠定了实验基础。

新型冠状病毒主蛋白酶抑制剂的筛选方法研究进展

新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)席卷全球,具有较高的传染性和死亡率,但目前尚缺乏安全有效的COVID-19疫苗与治疗药物。新型冠状病毒主蛋白酶(main protease,Mpro)的进化高度保守,在调控新冠病毒RNA复制中具有重要的生物学功能,已成为新型广谱抗冠状病毒药物开发的理想靶标之一。简便、快速、灵敏、经济的药物高通量筛选模型的建立是高选择性Mpro抑制剂高效筛选与开发的重要基础和关键技术。本文对Mpro分子结构及其抑制剂的筛选方法研究进展进行了综述和展望,以期为靶向Mpro广谱抗冠状病毒药物的筛选与开发提供有益的借鉴和参考。

大鼠抗新冠病毒主蛋白酶多克隆抗体的制备与鉴定

目的原核表达与分离纯化新冠病毒主蛋白酶(Mpro)并制备大鼠抗Mpro多克隆抗体用于研究Mpro在2019冠状病毒病(COVID-19)中的免疫学功能。方法将密码子优化的新冠病毒Mpro基因连接到pET-28a载体中,构建重组质粒pET-28a-Mpro。再将其转化到E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中,经原核表达条件优化后,以亲和层析法分离纯化Mpro。将纯化的Mpro作为抗原免疫大鼠,制备抗Mpro多克隆抗体。以ELISA和Western blot实验鉴定抗Mpro多克隆抗体的效价、抗原特异性与灵敏性。结果利用大肠杆菌原核表达技术,确定了Mpro的最佳表达条件并成功进行了分离纯化。ELISA与Western blot实验结果证实,制备的抗Mpro多克隆抗体效价可达1∶256000,且具有良好的抗原特异性与灵敏性。结论成功制备了高特异性大鼠抗Mpro多克隆抗体,为研究Mpro在COVID-19中的免疫学功能奠定了实验基础。

高亲和力重组人硫氧还蛋白还原酶的原核表达、纯化和初步活性鉴定

目的:分离纯化高亲和力的人硫氧还蛋白还原酶(TrxR)蛋白,完成初步的活性鉴定。方法:优化重组人TrxR蛋白的原核表达条件,再通过亲和层析法分离纯化得到高纯度的TrxR重组蛋白。采用5,5′-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DNTB)法比较重组人TrxR蛋白、商业化鼠肝提取TrxR蛋白以及重组人TrxR-ΔC蛋白的酶活力,并用TrxR特异性抑制剂金诺芬(Auranofin)分别检测其对三种蛋白的抑制效率。结果:优化了重组人TrxR蛋白的原核表达条件,得到高纯度目的蛋白。在8个测量时间点(120~330 s),TrxR的吸光度>pET-TRS TER>TrxR-ΔC(P<0.05)。TrxR和pET-TRS TER的抑制率随抑制剂浓度的减小而减小;TrxR-ΔC蛋白在抑制剂浓度0.00000477μmol/mL的活性低于其他10个浓度(0.01950~5.00000μmol/mL)(P<0.05);抑制剂在0.0000191μmol/mL浓度时蛋白活性低于抑制剂浓度为5.00000μmol/mL(P<0.05)。结论:获得高纯度、高活力的重组人TrxR蛋白,证明C端硒半胱氨酸是TrxR蛋白发挥活性的重要氨基酸。

大鼠抗人表皮生长因子受体3(ErbB3)二聚化界面区多克隆抗体的制备与鉴定

目的制备由人表皮生长因子受体3(ErbB3)二聚化界面区第236至308位氨基酸肽段(ErbB3Ⅱ)与麻疹病毒蛋白第288至302位氨基酸肽段(MVF)连接而成的融合蛋白MVF-ErbB3Ⅱ,并制备和表征其大鼠多克隆抗体.方法化学合成法合成MVF-ErbB3Ⅱ的基因,利用DNA连接酶与pET-21b载体连接成重组质粒,转化E.coli BL21(DE3)进行MVF-ErbB3Ⅱ原核表达,MVF-ErbB3Ⅱ经镍离子亲和层析法纯化后,免疫大鼠制备多克隆抗体,采用ELISA检测抗体滴度,Western blot法、免疫共沉淀法(IP)和流式细胞术鉴定抗体特异性和靶向性.结果SDS-PAGE证实大肠杆菌成功表达了MVF-ErbB3Ⅱ蛋白,ELISA结果表明多克隆抗体具有较高的抗体效价,Western blot法、IP和流式细胞术结果表明多克隆抗体具有良好的MVF-ErbB3Ⅱ及非变性ErbB3特异性和二聚化界面靶向性.结论成功进行了MVF-ErbB3Ⅱ原核表达和分离纯化及大鼠抗MVF-ErbB3Ⅱ多克隆抗体的制备和表征.

过表达TrxR1重组HEK293细胞株的构建和鉴定

目的构建稳定过表达硫氧还蛋白还原酶1(TrxR1)的HEK293细胞株,为TrxR1的功能研究以及靶向TrxR1药物筛选提供细胞模型。方法通过PCR扩增,连接转化以及Sanger双脱氧测序构建并筛选出TrxR1的重组慢病毒表达载体pLVX-Puro-TXNRD1,转染HEK293细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定转染细胞株。后续研究分为3组进行:①TrxR1过表达HEK293细胞:pLVX-Puro-TXNRD1载体稳定转染细胞;②对照HEK293细胞:pLVX-Puro空载病毒载体稳定转染细胞;③正常HEK293细胞;通过RT-qPCR、Western blot实验检测上述3组细胞中TrxR1的mRNA以及蛋白表达情况;通过胰岛素终点法以及TRFS-green探针成像检测上述3种细胞内TrxR1的酶活力;通过CCK8实验检测上述3种细胞对TrxR1特异性抑制剂auranofin的敏感性。结果构建载体经DNA测序,成功获得插入TrxR1的重组慢病毒表达载体pLVX-Puro-TXNRD1。与HEK293以及HEK293-NC细胞相比,HEK293-TrxR1-OE细胞中TrxR1的mRNA和蛋白高表达,且酶活力也同样显著上升(P<0.005);而与HEK293以及HEK293-NC细胞相比,auranofin对HEK293-TrxR1-OE细胞中TrxR1酶活力以及细胞增殖的抑制效率均显著下降(P<0.005)。结论通过构建pLVX-Puro-TXNRD1慢病毒载体,成功获得过表达TrxR1酶的HEK293细胞株,该细胞对特异性靶向TrxR1的抑制剂的抗增殖作用具有抵抗,因而可用于靶向TrxR1药物的筛选。

乳酸杆菌和沙门氏菌对BALB/c鼠感染旋毛虫的影响

目的分析保加利亚乳酸杆菌、沙门氏菌及培养上清对旋毛虫感染的BALB/c鼠体内成虫与肌幼虫荷虫量的影响,旨在为旋毛虫病的防治提供新思路,如以肠道菌为资源制成的疫苗或其他药物制剂。方法通过Real-time PCR技术对小鼠肠道菌群定量分析,确认保加利亚乳酸杆菌和沙门氏菌定植;感染旋毛虫5d后,分析小鼠体内成虫荷虫量变化;感染旋毛虫35 d后,分析小鼠体内肌幼虫荷虫量变化。结果保加利亚乳酸杆菌和沙门氏菌均能促进小鼠排虫,分别引起成虫减少45.3%和22.3%,培养上清效果稍差,分别减少了29.0%和14.8%;两者分别引起肌幼虫减少54.0%和38.3%,培养上清分别引起肌幼虫减少43.7%和37.7%。结论保加利亚乳酸杆菌和沙门氏菌均能够保护BALB/c鼠减少旋毛虫的感染。

新冠病毒主蛋白酶特异性荧光底物ddRFP-M的制备与鉴定

传统的新冠病毒主蛋白酶(main protease, Mpro)多肽底物具有制备成本高、稳定性差和合成工艺复杂等缺点,积极开发廉价稳定的新型底物具有重要意义。本研究基于二聚化红色荧光蛋白(dimerization-dependent red fluorescent protein, ddRFP)原理,以AVLQS为连接肽,利用基因工程技术制备Mpro特异性荧光底物ddRFP-M,用于Mpro抑制剂的药理活性评价。将连接肽基因插入到密码子优化的RFP-A_1与RFP-B_1基因之间,构建ddRFP-M基因,再将其克隆到pET-28a载体中构建重组质粒。将重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,以卡那霉素抗性法筛选重组子。重组子经低温诱导后,在大肠杆菌中进行荧光底物ddRFP-M的可溶表达,并以HisTrap~(TM)层析柱进行分离纯化。以荧光动力学检测法和电泳法测定ddRFP-M的底物特异性,并利用荧光底物ddRFP-M评价恩赛特韦和黄芩素的药理活性。结果显示,荧光底物ddRFP-M在大肠杆菌中呈可溶表达并成功进行了分离纯化,其具有良好的底物特异性、灵敏性和可靠性。新冠病毒Mpro特异性荧光底物ddRFP-M的制备,为新冠病毒Mpro抑制剂的药理活性评价奠定了基础。

靶向β-catenin/TCF4相互作用小分子抑制剂荧光偏振高通量筛选模型的建立与应用

基于荧光偏振(fluorescence polarization, FP)原理,建立并应用以β-catenin/TCF4 (T-cell factor 4)相互作用为靶标的小分子抑制剂荧光偏振高通量筛选模型获得苗头化合物。利用大肠杆菌原核表达系统,原核表达和分离纯化重组人β-catenin,以酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)进行生物学活性鉴定。以异硫氰酸荧光素(fluorescence isothiocyanate, FITC)标记的TCF4多肽为荧光探针,通过优化FITC-TCF4与β-catenin反应浓度,建立并应用靶向β-catenin/TCF4相互作用小分子抑制剂荧光偏振高通量筛选模型进行苗头化合物筛选。利用大肠杆菌原核表达系统成功进行了重组人β-catenin原核表达与分离纯化。ELISA实验证实了纯化的重组人β-catenin具有良好的生物学活性。选用20 nmol·L^-1FITC-TCF4和100 nmol·L^-1β-catenin,成功建立了Z’因子为0.88的荧光偏振高通量筛选模型。应用本筛选模型进行高通量筛选,成功筛选到了血根碱(sanguinarine)、白屈菜红碱(chelerythrine)和化合物S720具有良好的抑制活性。本研究成功建立了适用于靶向β-catenin/TCF4相互作用小分子抑制剂筛选的荧光偏振高通量筛选模型,为新型Wnt抑制剂的高效化和理性化发现奠定了基础。

基于比色法原理的新冠病毒主蛋白酶小分子抑制剂高通量筛选模型的优化与应用

本研究优化并建立了新冠病毒主蛋白酶(main protease,M^(pro))小分子抑制剂比色法高通量筛选模型,以期快速筛选天然产物来源的新型苗头化合物。基于比色法原理,以TSAVLQ-pNA(para-nitroanilide)作为M^(pro)水解底物,通过优化pNA底物浓度、M^(pro)工作浓度、最佳反应时间、二甲基亚砜耐受浓度等影响因素,建立M^(pro)小分子抑制剂比色法高通量筛选模型并用于天然产物化合物库的快速筛选。通过一系列反应条件优化,选择0.4μmol·L^(-1) M^(pro)和100μmol·L^(-1) pNA底物,成功地建立了Z'因子值为0.9的比色法高通量筛选模型。通过对天然产物化合物库进行高通量筛选,证实了白果新酸(ginkgolic acid C13:0)在体外对M^(pro)酶活性具有良好的竞争性抑制作用。本研究成功建立了新冠病毒M^(pro)小分子抑制剂比色法高通量筛选模型,为抗新冠病毒药物先导化合物的筛选与发现奠定了实验基础。

新冠病毒主蛋白酶小分子抑制剂荧光共振能量转移高通量筛选模型的优化与应用

基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)原理,以新冠病毒主蛋白酶(main protease, Mpro)为靶标,建立并应用Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型,以期快速筛选新型Mpro小分子抑制剂。利用大肠杆菌原核表达与分离纯化高活性的Mpro,再以FRET法进行比活力测定。基于FRET原理,以7-甲氧基香豆素-4-乙酸(7-methoxycoumarin-4-acetic acid, MCA)与2,4-二硝基苯酚(2,4-dinitropheno, Dnp)标记的多肽作为Mpro水解底物,通过优化反应缓冲液、Mpro反应浓度、反应温度与时间及DMSO耐受浓度,建立并应用Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型进行苗头化合物的筛选。利用大肠杆菌实现了高活性Mpro的原核表达与分离纯化,且比活力不低于40 000 U/mg。通过一系列优化实验,使用0.4μmol/L Mpro与5μmol/L底物建立了Z′因子值为0.79的Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型,且反应体系中含有的二硫苏糖醇(1,4-dithiothreitol,DTT)是影响FRET筛选模型可靠性的重要因素。通过对天然产物化合物库进行高通量筛选,发现白花丹素与银杏酸在体外对Mpro酶活性具有良好的抑制作用。本研究建立了基于FRET原理的Mpro小分子抑制剂高通量筛选模型,初步证实了白花丹素与银杏酸是一类新型苗头化合物,为抗新型冠状病毒药物先导化合物的筛选与发现奠定了基础。

新型三明治样荧光偏振筛选模型在新型冠状病毒主蛋白酶小分子抑制剂筛选中的应用

新型冠状病毒主蛋白酶(main protease, Mpro)通过水解多聚蛋白质体(polyprotein)调控病毒基因组RNA复制,且人体不存在其同源蛋白酶,这使Mpro成为抗新型冠状病毒药物开发的理想靶标之一。本研究基于荧光偏振技术(fluorescence polarization,FP)和生物素-亲和素反应(biotin-avidin system, BAS)原理,成功地建立了三明治样荧光偏振筛选模型用于Mpro小分子抑制剂的快速筛选。通过对天然产物化合物库进行高通量筛选,发现了漆树酸(anacardic acid,AA)是Mpro的竞争型抑制剂,1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖(1,2,3,4,6-O-pentagalloylglucose,PGG)是Mpro的混合型抑制剂,且已报道的部分抑制剂是非特异性Mpro小分子抑制剂。文中建立的三明治样荧光偏振筛选模型具有良好的简便性、灵敏性和稳定性,初步证实了漆树酸和PGG是一类新型苗头化合物,建立科学严谨的活性评价体系对于抗新型冠状病毒药物的筛选与发现是至关重要的。

靶向β-catenin/TCF4相互作用抑制剂在肿瘤分子治疗中的研究进展

经典Wnt信号通路的异常活化与恶性肿瘤的发生与发展密切相关,β-catenin/TCF4 (T-cell factor 4)相互作用作为Wnt信号通路中的"分子开关",促进了肿瘤的转移与复发,被认为是广谱高选择性抗肿瘤药物开发的理想靶标之一。目前, PKF222-815、iCRT3/5/14、LF3和血根碱等靶向β-catenin/TCF4相互作用的抑制剂已在结直肠癌和肝癌等肿瘤的实验治疗中展现出良好的应用前景。本文将对β-catenin分子结构、生物学功能及β-catenin/TCF4相互作用抑制剂的研究进展进行综述和展望,以期为新型高选择性Wnt抑制剂的筛选与发现提供有益的借鉴和参考。

靶向β-catenin/TCF4相互作用小分子抑制剂酶联免疫吸附法高通量筛选模型的优化与应用

在经典的Wnt/β-catenin信号通路中,β-catenin/TCF4(T-cell factor 4)相互作用在非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)的生长分化、化疗耐药、转移复发等过程中发挥着重要的促进作用,已成为新型靶向性抗NSCLC转移药物开发的理想靶标之一。为了高效地发现抑制β-catenin/TCF4相互作用的苗头化合物,本研究在应用酶联免疫吸附实验(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)原理的基础上,通过优化GST-TCF4βBD包被浓度和β-catenin反应浓度,建立ELISA高通量筛选模型并成功应用于苗头化合物的筛选。ELISA筛选模型优化实验结果表明,选用2μg/mL GST-TCF4βBD和0.5μg/mLβ-catenin建立ELISA高通量筛选模型,其Z′因子值为0.83,并成功筛选到具有良好抑制活性的白花丹素(Plumbagin)。肿瘤细胞增殖实验结果表明,白花丹素对A549、H1299、MCF7和SW480细胞具有明显的细胞毒性。TOPFlash实验结果证实,白花丹素对转染的HEK293细胞内β-catenin介导的转录活性具有显著的抑制作用,β-catenin/TCF4相互作用可能是白花丹素抗癌活性的潜在分子靶标之一。文中以β-catenin/TCF4相互作用为靶标,通过系统的实验优化方案,成功地建立了适用于药物高通量筛选的ELISA筛选模型,为高效筛选靶向β-catenin/TCF4相互作用的小分子抑制剂奠定了实验基础。

登革病毒NS2B-NS3蛋白酶在大肠埃希菌中表达条件的优化及酶活性测定

目的在大肠埃希菌(E.coli)中表达登革病毒(dengue virus,DENV)NS2B-NS3蛋白酶,对表达条件进行优化,并测定酶活性,为抗DENV药物先导化合物的筛选与发现奠定基础。方法将密码子优化的NS2B-NS3基因连接到pET-28a载体中,构建重组原核表达质粒pET-28a-NS2B-NS3,转化至E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导NS2BNS3蛋白酶表达。通过优化诱导时间、诱导温度和IPTG诱导浓度,确定NS2B-NS3蛋白酶在E.coli中的最佳表达条件。使用HisTrap^(TM)亲和层析柱分离纯化NS2B-NS3蛋白酶,通过荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)试验测定酶活性。结果重组原核表达质粒pET-28a-NS2B-NS3经双酶切(NheⅠ/XhoⅠ)及测序证明构建正确。NS2B-NS3蛋白酶在E.coli中的最佳表达条件为:诱导温度20℃,诱导时间10 h,IPTG浓度0.2 mmol/L,表达量达20 mg/L。纯化的NS2B-NS3蛋白酶纯度大于90%,可与小鼠抗His-tag单克隆抗体特异性结合,且具有良好的水解活性,其比活力为16111 U/mg、米氏常数(K_(m))值为16.46μmol/L、催化常数(k_(cat))值为0.028/s。结论成功制备了高纯度、高活性的DENV NS2B-NS3蛋白酶,为NS2B-NS3蛋白酶抑制剂高通量筛选模型的建立奠定了实验基础。