人乳头瘤病毒16型甲基化水平与子宫颈病变程度关系的研究

目的定量检测位于人乳头瘤病毒16(HPV16)L1基因3′端和LCR基因18个CpG甲基化水平,了解HPV 16甲基化与子宫颈病变的关系。方法选取本院就诊HPV16阳性正常/低度病变、高度病变、子宫颈癌标本各10例患者,采用重硫酸盐-焦磷酸测序方法分析HPVl6甲基化与子宫颈病变的关系。结果 Ll基因3′端的位点7089在正常/低度病变标本的甲基化率最高,其次是子宫颈癌,高度病变标本的甲基化率最低,3组比较差异有统计学意义(P=0.006);3组在位点7 134中甲基化率差异有统计学意义(P=0.01),与正常/低度病变标本比较,子宫颈癌及高度病变甲基化率差异均具有统计学意义(P分别为0.038、0.017)。结论 HPVl6 L1基因3′端甲基化位点7089、7134的甲基化水平与子宫颈病变程度存在相关性,HPVl6型DNA甲基化检测可用于临床上子宫颈病变筛查。

2022至2023年沈阳市儿童EB病毒感染血清流行病学分析

目的分析2022年至2023年沈阳市儿童EB病毒(EBV)感染的血清流行病学特征。方法收集2022年6月至2023年5月我院就诊的12083例疑似EBV感染患儿的一般资料及EBV相关血清学指标。采用LIAISION化学发光仪检测患儿血清中抗衣壳抗原IgM(VCA-IgM)抗体、抗衣壳抗原IgG(VCA-IgG)抗体、抗核抗原IgG(EBNA-IgG)抗体及抗早期抗原IgG(EA-IgG)抗体,采用实时PCR法检测EBV-DNA。比较不同性别、年龄及发病季节之间抗体阳性的差异。结果12083例患儿中VCA-IgM、VCA-IgG、EBNA-IgG、EA-IgG抗体阳性分别为1202例(9.95%)、6110例(50.57%)、5562例(46.03%)及596例(4.93%)。VCA-IgM、EA-IgG阳性率男患儿(分别为9.09%;4.44%)均低于女患儿(分别为11.10%、5.60%),差异均有统计学意义(均P<0.05)。不同年龄段(0~1岁,>1~3岁,>3~5岁,>5~10岁,>10~18岁)患儿VCA-IgM、VCA-Ig G、EBNA-IgG、EA-IgG抗体阳性率差异均有统计学意义(均P<0.05)。不同季节之间比较,VCA-IgG、EBNA-IgG和EA-IgG抗体阳性率总体差异有统计学意义(均P<0.05)。共检出14种EBV抗体阳性组合,其中,VCA-IgG、EBNA-IgG抗体均阳性患者最多,为4741例(39.24%)。进行EBV-DNA检测的3712例患儿中,EBVDNA阴性3034例(81.73%),EBV-DNA阳性678例(18.27%),EBV-DNA阴性、阳性患儿中均是VCA-IgG和EBNA-IgG抗体双阳性患者最多,分别为983例(26.48%)和194例(5.23%)。结论沈阳市儿童EBV感染以VCA-IgG、EBNA-IgG抗体双阳性为主,EBV抗体阳性率男性低于女性,不同年龄、不同发病季节患儿EBV抗体阳性率均存在差异。

荧光定量聚合酶链式反应法检测婴儿尿液人巨细胞病毒DNA对人巨细胞病毒感染的诊断意义

目的探讨荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)方法检测婴儿尿液人巨细胞病毒(HCMV)DNA水平对婴儿HCMV感染的诊断价值。方法采用FQ-PCR检测348例临床疑似HCMV感染婴儿尿液中HCMVDNA水平。同时采用化学发光免疫分析法(CLIA)检测婴儿血清HCMV-IgM抗体。在尿液HCMVDNA检测阳性患儿中比较血清HCMV-IgM抗体检测阳性与阴性患儿尿液中HCMVDNA拷贝数差异。结果FQ-PCR检测尿液HCMVDNA的阳性率为41.74%,CLIA检测婴儿血清HCMV-IgM抗体的阳性率为19.83%。2种方法对HCMV感染诊断的符合率为76.7%。前者诊断阳性率显著高于后者(χ2=69.44P<0.01)。在尿液HCMVDNA检测阳性患儿中,IgM抗体阳性组尿液HCMVDNA拷贝数显著高于阴性组(P<0.01)。结论FQ-PCR检测尿液HCMVDNA是早期诊断婴儿HCMV感染的敏感有效的方法。HCMV感染婴儿尿液中高HCMVDNA拷贝数与活动性HCMV感染密切相关;FQ-PCR方法检测尿液HCMVDNA水平对于判断是否为HCMV活动性感染具有一定意义。

不同人乳头瘤病毒亚型感染与宫颈病变的相关性

目的探讨不同人乳头瘤病毒(HPV)亚型感染与宫颈病变的关系以及不同年龄患者中HPV亚型感染与宫颈病变的关系。方法回顾性分析于中国医科大学附属盛京医院就诊的1615例宫颈病变患者的临床资料,统计分析不同HPV亚型的感染情况及其与宫颈病变的关系;并按不同年龄分层,分析不同HPV亚型感染与宫颈病变的关系。结果HPV16亚型阳性检出率最高,HPV58、HPV53、HPV33次之。与宫颈病变有关的HPV亚型包括HPV16、HPV53、HPV58、HPV52、HPV42、HPV33、HPV56和HPV31。按不同年龄分层后,发现15~30岁患者中不同级别宫颈病变与HPV45有关,31~45岁患者中不同宫颈病变与HPV33、HPV56有关,46~60岁患者中不同宫颈病变与HPV16、HPV18有关,61岁以上患者中不同宫颈病变与HPV6、HPV16及HPV33有关。结论30岁以上的女性应定期进行HPV检测,对宫颈病变进行筛检,以加强对宫颈癌的预防。

人乳头瘤病毒分型检测在宫颈癌机会性筛查中的应用

目的探讨门诊女性人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染的常见基因型;评价导流杂交基因芯片技术(简称HybriMax)在发现宫颈病变中的价值。方法采用HybriMax技术对9 802例有性生活史的门诊就诊女性进行下生殖道HPV感染分型检测,分析门诊女性HPV感染的常见基因型。其中1 061例患者同期行病理组织学诊断,按病理结果分为宫颈炎组489例、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasm,CIN)Ⅰ120例、CINⅡ/Ⅲ369例和宫颈癌83例,以病理诊断为金标准,评价HybriMax在筛查宫颈病变中的价值。结果9 802例门诊女性中前5种常见的HPV感染型别(按阳性率递减)依次为HPV16(14.38%)、HPV58(6.96%)、HPV52(5.26%)、HPV33(3.59%)、HPV53(3.29%)。宫颈癌组依次为HPV16、18、58、33和39。HybriMax技术检测CINⅡ、Ⅲ和宫颈癌的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为88.50%、50.01%、56.82%、85.43%。结论门诊女性常见的HPV感染基因型为HPV16、58、52、33和53。HybriMax技术对发现CINⅡ、Ⅲ和宫颈癌有较好的敏感性和特异性,适合于宫颈病变的大规模筛查和临床诊断。

黄疸婴儿人巨细胞病毒的检测

目的:探讨黄疸婴儿HCMV感染的诊断.方法:FQ-PCR检测248例黄疸婴儿和50例对照组患儿尿液中HCMV DNA,化学发光免疫分析法(CLIA)检测黄疸婴儿血清HCMV IgM抗体,在尿液HCMV DNA阳性黄疸婴儿中,比较血清HCMV IgM抗体阳性与阴性组HCMV DNA拷贝数的差异.结果:黄疸婴儿尿液HCMV DNA的阳性率为41.5%,对照组患儿阳性率为2.0%,两者有统计学意义(P<0.01).CLIA检测黄疸婴儿血清HCMV IgM抗体的阳性率为19.8%.在尿液HCMV DNA检测阳性的黄疸患婴儿中,IgM抗体阳性组的尿液HCMV DNA拷贝数显著高于阴性组(t=5.51,P<0.01).结论:FQ-PCR检测尿液HCMV DNA是早期诊断婴儿HCMV感染的敏感有效的方法.

尿标本池检测法筛选新生儿先天性人巨细胞病毒感染

目的探讨敏感性强、特异性好、简便易行并能降低试剂和人力成本的适于大规模人巨细胞病毒(HCMV)感染筛查的方法。方法收集日龄<14 d的住院新生儿尿标本200例,每例标本分成2份,1份标本采用临床常规实时荧光定量PCR法(RT-QPCR)检测HCMV-DNA,1份尿标本进行尿池预混和三级筛检,即采用相同的操作方法、仪器和试剂进行20份/池的筛检,阳性池再进一步分为5份/池进行筛检,再阳性者进行单个标本检测。结果采用的RT-QPCR的最低检出量为10 copies/mL。在200例新生病儿尿标本中,分别用标准法和尿池法检测,均有4例相同的标本为HCMV-DNA阳性。多份样本混合在同一检测池中未发现抑制物质对检测的影响。尿池法检测患者标本节约近80%的试剂成本。结论尿池法除具有标准RT-QPCR法的优点外,极大地降低了试剂和人力成本,适合于大规模新生儿HCMV先天性感染的筛查。

人巨细胞病毒UL135蛋白结合蛋白的酵母双杂交筛选

目的利用酵母双杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选与人巨细胞病毒(HCMV)UL135编码蛋白相互作用的蛋白。方法将成功构建的酵母诱饵表达载体pGBKT7-UL135转化到酵母菌AH109中,再将人胎脑文库DNA转化到含有pGBKT7-UL135的酵母细胞中,筛选与HCMVUL135编码蛋白相互作用的细胞蛋白,并对阳性克隆进行测序和生物信息学分析。结果最终确认60个克隆与HCMVUL135编码蛋白相互作用,其中2个克隆与Thy-1高度同源。结论成功应用酵母双杂交系统筛选出与HCMVUL135编码蛋白相互作用的蛋白,其中Thy-1在HCMV感染致病过程中可能起重要作用。

人巨细胞病毒miR-UL22A的重组载体构建以及表达分析

优化构建人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)miR-UL22A的真核表达载体;明确HCMV临床株及实验室株感染过程中miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p的表达情况。扩增HCMV UL22A编码区不同长度(975、494、209及140 bp)的序列,构建表达miR-UL22A的重组p Silencer(p S)载体,转染人胚肾293细胞后提取总RNA;收集HCMV临床株Han株以及实验室株Towne株感染人胚肺成纤维细胞后6、12、24、48和72h以及不同感染时相(即刻早期、早期、晚期)的总RNA标本;应用Taq Man颈环-实时荧光定量PCR技术检测上述标本miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p的表达量。成功构建了包含上述不同长度miR-UL22A编码序列的重组载体;侧翼序列长度各为40 bp左右的pre-miRNA(即插入140 bp的编码序列)表达成熟miRNA的效果最佳;在病毒的一个复制周期内,HCMV临床株和实验室株miR-UL22A的表达趋势无明显差异,均在感染后6h即检测到表达,72 h达到峰值,且在即刻早期即有miRNA的明确表达;无论是在重组载体表达状态下还是自然感染状态下,miR-UL22A-5p始终为miR-UL22A前体优势表达的miRNA。结果表明,有140 bp片段miRUL22A编码序列的重组载体能够高效地异源表达miR-UL22A-5p及miR-UL22A-3p;miR-UL22A-5p始终为miR-UL22A前体优势表达的miRNA。为进一步研究miRNA转录后调控作用提供了参考。

与人巨细胞病毒UL130编码蛋白相互作用蛋白的筛选

目的利用酵母双杂交技术筛选与人巨细胞病毒(HCMV)UL130表达产物有相互作用的细胞蛋白及其编码基因,了解其在宿主基因组中的地位功能。方法将成功构建的酵母诱饵表达载体pGBKT7-UL130转化到酵母菌AH109中,再将人胎脑文库DNA转化到含有pGBKT7-UL130的酵母细胞中,筛选与HCMVUL130编码蛋白相互作用的细胞蛋白,并对阳性克隆进行测序和生物信息学分析。结果最终确认9个克隆与HCMVUL130编码蛋白相互作用,其中2个克隆与突触小体相关蛋白(SNAP)高度同源。结论成功应用酵母双杂交系统筛选出与HCMVUL130编码蛋白相互作用的蛋白,其中SNAP在HCMV感染致病过程中可能起重要作用。

人巨细胞病毒UL141A和B片段在黄疸和先天性巨结肠分离株中的序列分析

目的:分析来自黄疸和先天性巨结肠(hirschsprung's disease,HD)患儿的人巨细胞病毒临床分离株UL141片段的序列变化,以及这种变化与人巨细胞病毒感染导致不同消化系疾病之间的关系.方法:对荧光定量PCR方法检测HCMV-DNA阳性的临床低传代分离株进行UL141基因全序列PCR扩增,对扩增阳性的标本进行测序及分析.结果:15株临床低传代分离株在Toledo株UL141基因227位均缺失一个碱基T,因此产生两个新的ORF(UL141A和UL141B).与Toledo株相应片段比较,UL141A预测蛋白质第75位氨基酸后序列和翻译后修饰位点产生大量变异.UL141B的核苷酸和氨基酸序列均高度保守.结论:来自黄疸和先天性巨结肠患儿的人巨细胞病毒临床分离株的UL141片段产生两个新的ORF。

黄疸患儿感染的人巨细胞病毒UL149基因编码产物结合多肽的氨基酸序列分析

目的:初步确定能够与黄疸患儿感染的人巨细胞病毒UL149基因编码产物具有较强结合能力的多肽,并分析这些多肽氨基酸序列的特点.方法:应用多肽文库展示技术筛选与来源黄疸患儿的人巨细胞病毒临床低传代分离株UL/b'区基因中的UL149基因编码产物结合的多肽克隆,对相应的多肽氨基酸序列进行同源性比较,并与蛋白数据库中已知的蛋白序列进行比较.结果:与黄疸患儿感染的人巨细胞病毒UL149基因编码产物具有结合能力的多肽序列之间具有较高的同源性,氨基酸序列中存在较为集中的区域,即D/E-D/E-G-W/F/I/L;与已知蛋白数据库进行比较,发现与人免疫球蛋白重链可变区关系密切,亦与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、人巨细胞病毒的立刻早期基因UL37、gpB等存在结合关系.结论:在黄疸患儿感染的人巨细胞病毒UL149基因编码产物可能与人巨细胞病毒的gpB、立刻早期基因UL37等具有联合作用,并且可能参与HCMV的免疫逃避机制.

人巨细胞病毒ORF11基因在消化系统疾病临床分离株中的序列分析(英文)

目的研究人巨细胞病毒(hum an cytom egalovirus,H C M V)O R F11基因在临床分离株中的多态性及其与H C M V感染所致不同消化系统疾病之间的关系。方法研究对象为16名具有不同消化系统疾病的H C M V感染儿。对全部标本进行H C M V O R F11基因的半巢式PC R扩增。应用D N Aclub,BioEdit,PR O SITE数据库及D N Astar软件对PC R产物的序列进行分析。结果所有临床分离株H C M V O R F11的核苷酸序列是保守的,而其编码蛋白翻译后修饰位点的氨基酸序列则高度保守。未发现H C M V O R F11序列的变异与不同表现类型的消化系统疾病相关。结论 H C M V O R F11基因相对保守,不同分离株的序列变异与不同临床表现的消化系统疾病没有明确的相关性。

酵母双杂交技术筛选人巨细胞病毒UL131A的相互作用蛋白

目的:利用酵母双杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选与人巨细胞病毒(HCMV)UL131A编码蛋白相互作用的蛋白.方法:将成功构建的酵母诱饵表达载体pGB-KT7-UL131A转化到酵母菌AH109中,再将人胎脑文库DNA转化到含有pGBKT7-UL131A的酵母细胞中,筛选与HCMV UL131A编码蛋白相互作用的细胞蛋白,并对筛选得到的阳性克隆进行测序和生物信息学分析.结果:成功构建酵母诱饵表达载体pGBKT7-UL131A,并将其与人胎脑cDNA文库共转化到酵母细胞AH109中,最终确认有23种人胎脑文库蛋白与HCMV UL131A编码蛋白相互作用,其中一种与Thy-1蛋白高度同源,其同源性高达99%.结论:成功应用酵母双杂交系统筛选出与HCMV UL131A编码蛋白相互作用的蛋白,其中Thy-1在HCMV感染致病过程中可能起重要作用.

人巨细胞病毒Han株US12基因缺失株的构建及其在人胚肺成纤维细胞中的复制

目的构建人巨细胞病毒(HCMV)Han株US12基因缺失的BAC毒株,研究US12产物对HCMV Han株在人胚肺成纤维细胞(HELF)中复制的影响。方法以侧翼含有US12基因同源序列的PCR引物扩增卡那霉素抗性基因,电转至含有Han株BAC质粒的大肠杆菌DY380-Han-wt-BAC,PCR及DNA测序验证US12缺失的病毒序列。将缺失突变质粒Han-ΔUS12-BAC-P电转至HELF,获得感染性病毒颗粒Han-ΔUS12-BAC。以MOI为0.1的Han-ΔUS12-BAC毒株及Han-wt-BAC毒株感染HELF,TCID50法测定上清中病毒滴度,绘制病毒增殖曲线。结果成功构建了Han-ΔUS12-BAC克隆,转染HELF后成功获得感染性病毒。生长曲线实验结果表明,ΔUS12缺失和野生型毒株在HELF中复制增殖与扩散水平无明显差异。结论 US12为HCMV临床株Han在HELF中增殖和扩散过程中的非必需基因。

不同年龄段患者中人巨细胞病毒的感染状况

目的了解沈阳地区不同年龄段患者中人巨细胞病毒(HCMV)的感染状况。方法选择疑似HCMV感染患者123616例,采用荧光定量PCR技术检测HCMV DNA,化学发光免疫分析法检测血清HCMV IgM和IgG抗体,收集患者临床诊断信息。结果HCMV DNA、IgM抗体、IgG抗体阳性率分别为12.48%、2.34%、95.58%。>28 d~1岁组患儿HCMV DNA阳性率(31.52%)、IgM抗体阳性率(9.86%)最高。不同体液HCMV DNA阳性率不同,尿HCMV DNA阳性率(14.61%)大于血清(2.36%)和肺泡灌洗液(2.17%)。HCMV DNA阳性率与IgM抗体阳性率呈正相关,HCMV DNA阳性患者中,HCMV IgM抗体阳性者病毒载量高于IgM抗体阴性者。HCMV感染的临床诊断包括肺炎、神经系统损害、肝炎、血液病等。结论不同年龄段患者的HCMV感染状况存在差异。婴儿是HCMV易感人群,HCMV感染后主要累及肺脏、肝脏、神经系统等。多种体液样本HCMV DNA检测以及HCMV DNA与IgM抗体联合检测对HCMV检测和诊治有重要的意义。

人巨细胞病毒UL141编码蛋白相互作用蛋白的筛选和分析

目的应用酵母双杂交技术筛选人胎脑cDNA文库中与人巨细胞病毒(HCMV)UL141编码蛋白相互作用的蛋白,以进一步研究HCMV UL141的生物学功能,为揭示HCMV先天感染机制奠定基础。方法采用PCR技术扩增HCMV-UL141基因片段,将其插入到pGBKT7载体中,构建成诱饵质粒pGBKT7-UL141。然后将pGBKT7 UL141转化到酵母感受态细胞AH109中,于一缺培养基(SD/Trp)上筛选生长。再将人胎脑cDNA文库质粒转化到含有pGBKT7-UL141质粒的AH109菌株中,在四缺培养基(SD/Trp/Leu/His/Ade)中筛选相互作用的人胎脑cDNA文库蛋白。通过显色反应挑选显蓝色的阳性克隆,提取相应质粒将其转化到大肠杆菌中,并进行回转验证。最后对筛选得到的阳性克隆进行测序及生物信息学分析。结果诱饵质粒pGBKT7UL141构建成功。筛选获得6个克隆与HCMV-UL141编码蛋白相互作用,其中1个基因编码人类染色质解旋酶DNA结合蛋白3(CHD3)。结论成功应用酵母双杂交系统筛选出与HCMV-UL141编码蛋白相互作用的人体组织蛋白——CHD3,提示UL141蛋白可能与病毒的免疫逃避,干扰正常细胞的生长、分化相关。

人巨细胞病毒微小RNAmiR-UL70-5P靶向抑制人即刻早期反应蛋白3的表达

目的寻找人巨细胞病毒微小RNA mi R-UL70-5P调控的靶m RNA,检测mi R-UL70-5P对靶m RNA蛋白质表达的调节作用。方法采用Hybrid-PCR方法从人巨细胞病毒感染的人胚肺成纤维细胞总RNA中筛选候选靶m RNA;采用荧光素酶实验验证mi R-UL70-5p与候选靶m RNA的结合能力;采用Western blot方法检测转染mi R-UL70-5P对部分靶m RNA蛋白质表达的调节作用。结果筛选并鉴定了人即刻早期反应蛋白3(IER3)等7种靶m RNA可与mi R-UL70-5P特异性结合;在293T细胞中过表达的IER3可以被转染的mi R-UL70-5P下调30%。结论人巨细胞病毒表达的mi R-UL70-5P在病毒感染宿主过程中具备抑制IER3蛋白质表达的能力。

细菌人工染色体技术在人巨细胞病毒基因组小片段序列置换突变中的应用

目的评估细菌人工染色体技术在人巨细胞病毒(HCMV)基因组小片段序列突变中的作用。方法选取HCMV LUNA基因位于UL80与UL82 2个基因之间的31 bp片段作为突变靶点,用含有同源臂的卡那霉素抗性序列对目的片段进行同源重组置换,电转化法对突变成功的病毒进行拯救,反转录PCR和cDNA克隆测序对LUNA,UL80及UL82 mRNA转录情况和转录本3’末端结构进行分析。结果目的基因片段缺失成功,获得的单克隆中突变成功的比例>3%,LUNA转录起始端序列突变的病毒拯救成功,UL80与UL82的m RNA转录与转录本3’结构未受影响。结论通过人工染色体技术成功进行了HCMV Han株LUNA基因转录起始端序列突变,HCMV Han株细菌人工染色体支持有效缺失小至31 bp的基因片段。

2014—2018年沈阳地区手足口病病原分布及流行特征

目的探讨沈阳地区手足口病病原体分布及流行特征,为手足口病的防控和临床诊治提供参考依据。方法采用描述性流行病学方法,对2014—2018年中国医科大学附属盛京医院就诊的手足口病患儿病例信息及病原学监测数据进行分析。结果共接诊临床诊断手足口病患儿25571例,17263例(67.51%)肠道病毒检测阳性,其中男患儿阳性检出率为69.72%(10305/14780),女患儿阳性检出率为64.48%(6958/10791),男女患儿阳性检出率比较,差异有统计学意义(χ2=78.167,P<0.001)。手足口病肠道病毒检测阳性患儿中,<6岁者占92.59%,其中3~岁年龄组占比最高(24.53%)。手足口病全年均有发病,但季节分布明显,呈单峰状分布,每年7、8月份最高,占比为29.94%~52.30%。手足口病分离病原体EV-71占12.71%,CV-A16占24.38%,其他肠道病毒占62.91%。结论除EV-71和CV-A16外沈阳地区手足口病患儿感染其他肠道病毒所占比例较高,每年7、8月份为手足口病高发期,以<6岁的儿童发病为主,男孩发病居多。