LRRC15影响A549细胞自噬的作用研究

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种致病原因不明、进行性、慢性不可逆的间质性肺疾病。为探讨富含亮氨酸重复蛋白15(leucine-rich repeat-containing protein 15,LRRC15)在IPF的作用及调节机制,本研究构建了博来霉素(bleomycin,BLM)诱导的小鼠肺纤维化和A549细胞损伤模型,检测了LRRC15的表达变化。转染siLRRC15后分别采用MTT、GFP-RFP-LC3双荧光标记系统和免疫印迹等方法检测了细胞活性和自噬的变化。结果表明:BLM处理后,小鼠肺组织和A549细胞中LRRC15表达显著上调;将设计和合成的siLRRC15转入A549细胞,LRRC15的表达极显著降低,可以部分恢复BLM引起的细胞损伤;BLM处理A549细胞后,LC3-Ⅱ和P62蛋白呈现上升的趋势;GFP-RFP-LC3双荧光标记检测发现,BLM处理后自噬体数量明显增多;进一步用siLRRC15处理A549细胞后发现,自噬关键蛋白LC3-Ⅱ、ATG5、ATG7的表达增加,P62蛋白表达下调,自噬流的强度增加。以上研究结果说明LRRC15是IPF中上皮细胞损伤的指示剂,可能通过调节自噬参与纤维化过程中的调节,本研究为进一步阐明IPF的机制提供了必要的理论依据。

肝再生细胞周期中增殖启动及其调控研究

肝再生细胞周期中增殖启动及其调控是一个研究热点,到底是何种因素及其涉及到的信号传导途径诱导了Go期肝细胞的启动仍然是一个谜.本文主要以JNK、TNF-α、IL-6、一氧化氮等因子及其可能参与的调控途径综述了肝再生启动的一些最新研究进展.

槲皮素对细菌脂多糖诱导流产小鼠子宫蜕膜巨噬细胞功能的影响

目的:探讨槲皮素对细菌脂多糖(LPS)诱导流产小鼠的免疫抑制机制及其保胎作用。方法:将孕鼠随机分为对照组和实验组,对照组为PBS处理组,实验组分别为LPS流产模型组、槲皮素处理组、槲皮素+LPS处理组。每组小鼠分别在末次注射后的1、3、6、12、24h脱颈椎处死,剖腹取其子宫,观察妊娠结果。免疫组织化学方法检测CD14^+巨噬细胞数量和CD14表达量,ELISA方法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的含量。结果:模型组小鼠流产率和胚胎吸收率均为100%,槲皮素+LPS处理组流产率降低为40%,胚胎吸收率降至36.18%。与对照组相比,槲皮素+LPS组小鼠子宫蜕膜组织CD14^+巨噬细胞数量、CD14表达量、TNF-α和MCP-1的含量均显著增加。与模型组相比,槲皮素+LPS组小鼠各时间点CD14^+巨噬细胞数量及CD14表达量、TNF-α和MCP-1的含量均显著降低。结论:槲皮素通过抑制MCP-1的生成,从而阻止巨噬细胞向子宫内膜迁移,并且下调CD14的表达,减少TNF-α的分泌,是其对抗LPS诱导流产的免疫作用机制之一。

花旗松素、槲皮素对LPS诱导流产小鼠子宫巨噬细胞的抑制作用

目的:探讨花旗松素和槲皮素对细菌脂多糖(LPS)诱导流产小鼠子宫巨噬细胞的免疫抑制作用。方法:昆明种正常孕鼠90只,随机分为对照组(A组);实验组均于孕6天尾静脉注射LPS 0.2 ml诱导流产小鼠,并分为LPS处理组(B组),低浓度花旗松素及LPS双处理组(C1组)、高浓度花旗松素及LPS双处理组(C2组)、低浓度槲皮素及LPS双处理组(D1组),高浓度槲皮素及LPS双处理组(D2组),每组15只。用酶组织化学、免疫组化和ELISA方法检测孕9天子宫角组织非特异性酯酶阳性(α-NAE+)巨噬细胞,CD14+巨噬细胞和TNF-α含量。结果:B组小鼠流产率为100%,胚胎吸收率为100%(P<0.01);灌胃花旗松素和槲皮素可以显著抑制流产模型小鼠的流产率和胚胎吸收率(P<0.01)。B组孕鼠子宫内膜和肌层α-NAE+,CD14+巨噬细胞数量和阳性面积与A组相比均显著增多(P<0.01);各双处理组与B组相比,子宫内膜和肌层α-NAE+巨噬细胞和CD14+巨噬细胞数目和阳性面积显著减少(P<0.01)。B组孕鼠子宫TNF-α含量与A组相比显著增加(P<0.05),而双处理组接近正常水平。结论:通过抑制子宫巨噬细胞的数量、分布、活性和TNF-α分泌量,可能是花旗松素和槲皮素对抗LPS诱导小鼠流产的机理之一。

妊娠早期小鼠子宫巨噬细胞分布和活性的变化

目的:通过研究妊娠早期子宫CD14+巨噬细胞数量、分布及酸性磷酸酶(ACP)活性变化,探讨巨噬细胞与母胎免疫耐受的关系。方法:用免疫组织化学方法和酶细胞化学研究小鼠妊娠早期子宫CD14+巨噬细胞及ACP的变化。结果:对照组CD14+巨噬细胞主要分布在子宫内膜。小鼠妊娠后内膜中数目减少,第3日最少;肌膜和外膜巨噬细胞增加,第2日达到高峰。CD14免疫反应阳性面积变化趋势与此类似。第3～5日期间ACP的活性下降并维持在较低的水平。结论:巨噬细胞在着床期抗原识别和处理能力受到了抑制,参与了妊娠早期母胎免疫耐受的形成。

水红花子对LPS诱导流产小鼠子宫巨噬细胞的抑制效应及其保胎作用

目的:探讨水红花子对细菌脂多糖(LPS)诱导流产小鼠的免疫抑制及其保胎作用。方法:昆明种小鼠55只,随机分为对照组(A组,10只)和实验组。实验组又分为细菌脂多糖(LPS)处理组(B组),水红花子处理组(C组),水红花子及LPS双处理组(D组),每组各15只。观察妊娠结果,用酶组织化学、免疫组化和ELISA方法分别检测非特异性酯酶阳性(α-NAE+)、CD14+和CD204+巨噬细胞、TNF-α的变化。结果:B组小鼠流产率和胚胎吸收率均为100%(P<0.01);而D组流产率降低为13.33%,胚胎吸收率降至10.39%。与A组相比,在B组,α-NAE+、CD14+巨噬细胞数量和阳性面积,以及TNF-α含量均显著增加;在D组,环肌外侧极显著增多(P<0.01),但环肌内侧、功能层均接近正常水平。与A、B组相比,C、D组CD204+巨噬细胞数量和阳性面积均显著增多。结论:通过调节子宫巨噬细胞的表型、活性和TNF-α的分泌,可能是水红花子对抗LPS所致流产效应的机制之一。

孕酮对小鼠子宫巨噬细胞数量及膜受体CD14、CD204表达的影响

目的探讨孕酮对子宫巨噬细胞数量及其膜受体CD14、CD204表达的影响,以及孕酮和巨噬细胞在子宫局部免疫中的作用。方法 1.25只正常非孕鼠随机分为空白对照组、阴性对照组和低、中、高3个不同浓度孕酮处理实验组,每组5只。低、中、高浓度实验组每天分别皮下注射0.4mg、2.0mg、4.0mg孕酮,阴性对照组注射等体积芝麻油,连续注射5d;空白对照组不做任何处理。2.孕4d和5d小鼠各15只,分别随机分为空白对照组、阴性对照组和实验组,每组5只。实验组分别于当天早晨皮下注射4mg孕酮,阴性对照组注射等体积芝麻油,空白对照组不做任何处理。以上各组均于末次注射后6h取子宫,通过非特异性酯酶(α-NAE)染色和免疫组织化学检测子宫α-NAE+、CD14+、CD204+巨噬细胞的变化。结果与对照组相比,注射孕酮后,非孕鼠子宫内膜、肌层和外膜的α-NAE+及CD14+巨噬细胞极显著减少(P<0.01),并与剂量呈正相关,但未检测到CD204+巨噬细胞;孕4d、5d小鼠子宫α-NAE+、CD14+、CD204+巨噬细胞均显著增多(P<0.01)。结论孕酮可通过调节巨噬细胞数量、分布及膜受体的表达影响子宫局部免疫状态,替代途径活化的巨噬细胞可能介导了妊娠期母胎免疫耐受的维持。

小鼠子宫巨噬细胞的分离纯化与鉴定

目的建立一套简便易行、高效可靠的小鼠子宫巨噬细胞的分离纯化及鉴定方法。方法5只雌鼠处死并获取子宫,利用酶消化法和机械法相结合制备小鼠子宫组织单细胞悬液,密度梯度离心法收集子宫巨噬细胞,贴壁培养获得纯化的巨噬细胞。采用锥虫蓝拒染法鉴定巨噬细胞活率,利用鸡红细胞吞噬试验检测巨噬细胞吞噬活性,并通过酸性磷酸酶染色、非特异性酯酶染色和CD14免疫细胞化学染色鉴定巨噬细胞纯度。结果采用该法每只小鼠可获得子宫巨噬细胞3×10^5-5×10^5个,且活率达到（85.35±0.43）%,酶化学和免疫细胞化学鉴定阳性率分别达到了（86.12±1.19）%、（85.83±0.57）%和（84.02±1.64）%。结论成功建立了小鼠子宫巨噬细胞的分离纯化方法,并能获得较高的细胞存活率和纯度。

新蛋白C7orf42促进大鼠肝细胞BRL-3A增殖

目的探讨未知功能蛋白C7orf42对体外培养的大鼠肝细胞BRL-3A增殖的影响。方法基因干涉下调C7orf42表达后,用MTT、Ed U掺入法检测C7orf42对BRL-3A细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞周期进程以及Reat-time PCR和Western blotting检测细胞增殖相关基因表达。结果 MTT法检测表明,转染C7orf42干涉片段后48h,干涉组比阴性对照组细胞活力降低11%(P<0.05);Ed U掺入法检测表明,实验组的Ed U阳性细胞比率比对照组降低了13%(P<0.05);流式细胞术检测表明,干涉组比阴性对照组S+G2/M期的细胞数降低12%(P<0.05);Reat-time PCR检测表明,干涉C7orf42表达后细胞增殖相关基因JUN、CCND1、MYC和CCNA2的表达分别下调26%、31%、37%和14%(P<0.05);Western blotting检测表明,干涉C7orf42表达后细胞增殖相关蛋白JUN、CCND1、MYC和CCNA2的表达分别下调59%、54%、18%和27%(P<0.05)。结论 C7orf42可能通过上调细胞增殖相关蛋白JUN、CCND1、MYC和CCNA2的表达,促进体外培养的大鼠肝细胞BRL-3A增殖。

大鼠外周血单个核细胞保存方法研究

通过观察大鼠外周血单个核细胞（PBMCs）的形态，了解不同保存方法和不同保存时期对PBMCs活性和细胞周期分布的影响，建立其短期保存方法．用密度梯度离心法获得大鼠外周血单个核细胞，分别在RPMI1640培养液中4℃保存和冷冻保护剂中－80℃保存，并分别在第1－4天和第7天，14天，21天，28天，35天用台盼蓝染色法测定细胞活力，用流式细胞仪检测细胞周期．结果分离获得的PBMCs成活率为97．69％±1．59％，基本处于G0／G1期．PBMCs置4℃保存4d后，存活率在60．84％±2．75％；置－80℃保存35d后，存活率在78．54％±2．97％，PBMCs基本处于G0／G1期．最后得出－80℃低温保存方法对PBMCs活性和细胞周期检测有一定影响，但其活性率接近80％，是一种简便易行短期保存PBMCs的方法的结论．

镉诱导细胞自噬的研究进展

镉是一种有毒的重金属,其对环境和人类的健康造成巨大危害。越来越多的证据表明镉对多个器官和系统造成损害,甚至引起癌变和肿瘤。自噬是进化上保守的,利用溶酶体途径降解细胞内蛋白质和细胞器的过程。一方面,自噬通过清除受损的细胞器保护细胞免受镉损伤;而当细胞受到的损伤不可逆时,自噬作为一种死亡机制导致细胞死亡。自噬在镉引起的细胞损伤中的作用目前仍有争议,可能是镉的剂量和暴露时间的不同造成了自噬在损伤中的作用不同。目前对自噬在其中的作用机理研究,主要集中在m TOR,Ca2+,Beclin-1等信号分子。对镉与自噬分子机理的研究,可以为治疗和预防镉中毒提供新思路。综述了自噬在镉致细胞毒性中的作用,以及镉诱导细胞自噬的信号调节通路。

肝脏干细胞的来源与潜能

肝干细胞是肝脏内具有自我更新能力和多分化潜能的细胞,包括卵圆细胞、小型肝细胞和小肝细胞样前体细胞.其中,卵圆细胞可能来源于胚胎干细胞和/或骨髓干细胞.肝干细胞能分化为肝实质细胞和胆管上皮细胞,在一定条件下,还能分化为胰腺细胞、肠上皮细胞、肌细胞或转化为肝肿瘤细胞.

大鼠原代肝细胞的标记和移植方法

探讨CM-DiI标记大鼠原代肝细胞的最佳浓度、细胞的移植量和移植途径.采用原位胶原酶灌注和密度梯度离心法分离、纯化大鼠肝细胞,用不同浓度CM-DiI进行标记,筛选出CM-DiI的最佳标记浓度,分别从门静脉、尾静脉移植到2/3肝切除0h大鼠,对细胞移植36h后的肝组织石蜡切片和冰冻切片分别进行免疫组织化学分析和荧光观察.结果显示,4μmol·mL-1浓度的CM-DiI和肝细胞孵育5min,细胞标记率高达95%.每克大鼠残肝移植0.8mL的细胞悬液(107个·mL-1)和0.2,0.4,0.6mL移植后检测到的标记细胞数目相比有显著性差异(P<0.01),经肝门静脉移植后可以检测到的标记细胞数比尾静脉多(P<0.01).CM-DiI标记大鼠原代肝细胞的最佳浓度为4μmol·mL-1,标记细胞的最佳移植量为每克大鼠残肝移植0.8mL的细胞悬液(107个·mL-1)、最佳移植途径为经肝门静脉移植.

大鼠再生肝细胞的分离和培养

建立大鼠2/3肝切除模型,分别于术后恢复0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、120 h、168 h等时间点,采用原位胶原酶消化和密度梯度离心法分离、纯化再生肝细胞,获得的再生肝细胞活性95%以上,纯度96%以上。用DMEM培养液添加其他物质后培养再生肝细胞,在培养的96 h内,肝细胞生长状态良好,具有分泌白蛋白和合成尿素的功能。细胞的DNA合成主要在培养24 h以后,72 h时达到高峰。

Na5SeV5O18·3H2O对K562细胞线粒体凋亡和NF-κB／IκBα信号转导途径的影响

通过MTT比色法和Westernblot法检测NasSeV5O18·3H2O的抗肿瘤活性及作用机理．结果表明，Na5seV5O18·3H2O（0．625-20mg·L^-1）能抑制K562细胞增殖（P〈0．05）；药物处理K562细胞24h，可使胞浆细胞色素C，IκBα含量明显增多，核内NF-κB含量减少．结果提示Na5SeV5O36·3H2O能体外抑制K562细胞增殖，其机理可能与线粒体凋亡和NF-κB／IκBα信号转导有关．

三种含硒化合物对K562细胞的抑制作用

目的研究比较3种新的含硒化合物在体内、外的抗癌作用和作用机制。方法通过四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法和移植瘤生长抑制实验及形态学观察、流式细胞术以及激光扫描共焦显微镜,检测分析含硒化合物对K562细胞的抑制作用。结果3种含硒化合物能明显抑制K562细胞增殖（P〈0.05）和S180、H22移植瘤（n=10）的生长（P〈0.01）;使K562细胞出现体积缩小,细胞膜完整,染色质高度凝集,边集,核浓染、碎裂,伴有出泡现象和凋亡小体出现等典型的凋亡特征;对K562细胞的周期分布有明显影响,且在大剂量时出现了明显的亚二倍体峰;能够明显增加K562细胞内Ca^2＋、Mg^2＋和细胞内活性氧（ROS）的荧光强度（P〈0.01）,但pH值和线粒体膜电位显著降低（P〈0.01）。结论3种含硒化合物均有体内、体外抗肿瘤作用,其作用机制可能与Ca^2＋、Mg^2＋、（活性氧ROS）、pH值和线粒体膜电位（MMP）诱导的细胞凋亡有关。

红藤对LPS诱导流产小鼠的保胎作用及子宫巨噬细胞的影响

目的:探讨红藤对细菌脂多糖(LPS)诱导流产小鼠的保护作用及其免疫药理机制。方法:昆明种小鼠55只,随机分为对照组(A组,10只)和实验组。实验组又分为LPS处理组(B组)、红藤处理组(C组)、红藤及LPS双处理组(D组),每组各15只。观察妊娠结果,并用酶组织化学、免疫组化、ELISA方法检测子宫非特异性酯酶阳性(α-NAE+)、CD14+、CD204+巨噬细胞和TNF-α的变化。结果:小鼠流产率在B组为100%(P<0.01),胚胎吸收率为100%(P<0.01);而D组流产率降低为13.33%,胚胎吸收率降至12.56%;孕鼠子宫α-NAE+、CD14+巨噬细胞数量,B组子宫各部位与A组相比均显著增多(P<0.01);D组环肌外侧与A组相比显著增多(P<0.01),但环肌内侧、功能层无明显变化,C、D组CD204+巨噬细胞数量与A组、B组相比均显著增多(P<0.01);子宫TNF-α含量B组与A组相比显著增加(P<0.01),而D组接近正常水平。结论:红藤可以对抗LPS所致的小鼠流产,通过影响孕鼠子宫巨噬细胞的数量、分布和亚群,抑制TNF-α的分泌,是其保护胚胎正常发育的机理之一。

MCP-1对LPS致炎小鼠子宫巨噬细胞迁移和功能活性的调节

目的:探讨LPS诱导的炎症小鼠子宫巨噬细胞迁移和功能活性的调节因素。方法:将150只雌性昆明种小鼠随机分为对照组(A组)、LPS模型组(B组)、MCP-1阻断组(C组),于末次注射后的1、3、6、12、24 h取子宫。运用免疫组织化学方法检测CD14^+巨噬细胞数量与CD14表达的变化,ELISA方法检测TNF-α、MCP-1的表达量。结果:(1)与A组相比,B组内膜、肌层、外膜的CD14^+巨噬细胞数目及CD14表达量在各时间点均极显著增加(P<0.01),C组内膜和肌层在1、3、6 h时恢复至正常水平;与B组相比,C组外膜在1、3、6 h时以及C组的内膜和肌层在各时间点时CD14^+巨噬细胞数目及CD14表达量均极显著减少(P<0.01)。(2)与A组相比,B组在各时间点以及C组在12、24 h时TNF-α和MCP-1的含量极显著增多(P<0.01);与B组相比,C组各时间点的TNF-α和MCP-1的含量极显著减少(P<0.01)。结论:LPS诱导的小鼠子宫炎症反应中巨噬细胞的迁移及CD14、TNF-α等关键分子的表达均受MCP-1的调节。

建立基因协同作用算法解析大鼠肝再生中基因表达丰度预示的细胞增殖活动

随着生物高通量分析技术的发展，获得基因组／蛋白组数据已较易实现．然而解析这些数据的生物学意义尚有不少困难，亟待克服．从生理反应的多样性、多步骤性、可逆性、循环性、重复性、网络性、可控性、适应性等特点入手，以基因表达丰度为基础，根据时间序列分析原理，应用皮尔森相关系数建立了两种描述基因协同作用的谱函数E。（￡）和巨，用它们分析基因表达丰度、表达变化预示的大鼠肝再生中肝细胞的增殖活动．结果显示，大鼠肝再生的进展阶段，即PH后12～72h肝细胞的增殖活动显著强于对照．进一步分析相关文献资料发现，上述结果与文献报道一致，表明在解析生物高通量分析数据的生物学意义方面，基因协同作用算法有一定应用价值．

建立同类提取法从基因芯片检测数据中挖掘大鼠肝细胞的肝再生关键基因

为解析基因芯片检测数据的生物学意义,用Rat Genome 230 2.0芯片检测大鼠肝再生中肝细胞的基因表达丰度,用F检验大鼠2/3肝切除组(PH)与假手术组(SO)的基因表达差异性和获得大鼠肝细胞的肝再生相关基因,用同类提取法从过滤法计算的差异基因中筛选特征基因,根据特征基因的关联度、参与的生理活动和他人研究结果确认其中的关键基因.结果表明,Ccne1、Egf、Met等57个特征基因在大鼠肝再生中起关键作用.