犬黑皮质素受体4真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达

[目的]构建犬黑皮质素受体4真核表达载体并在COS-7细胞中进行瞬间表达。[方法]以犬MC4R线性DNA为模板,进行引物设计,PCR特异性扩增,扩增产物连接到pMD18-T载体上,酶切鉴定后测序。将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)。重组体pcD-NA3.1(+)-MC4R经过酶切和测序鉴定。采用FuGENE HD介导转染技术将pcDNA3.1(+)-MC4R导入COS-7细胞,提取细胞内总RNA,RT-PCR扩增犬MC4R基因的全长cDNA编码序列。[结果]克隆犬MC4R基因的全长cDNA序列,并以pcDNA3.1(+)表达载体为骨架,构建真核表达载体,测序的扩增片段与GenBank公布的模板序列经Blast比对相似性为99%。采用G418筛选,获得带有pcDNA3.1(+)-MC4R的COS-7细胞。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1(+)-MC4R,重组体能在真核细胞中表达。

人参皂苷Rg1对局灶性脑缺血大鼠PARP-1和TNFR1表达的影响

目的探讨人参皂苷Rg1对局灶性脑缺血大脑皮质多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)-1和肿瘤坏死因子受体(TNFR)1表达的影响。方法 90只健康SD大鼠随机均分为假手术组,单纯缺血组,人参皂苷Rg1低、中、高组,阳性对照组。于术前5 d至取材当日,假手术组与单纯缺血组分别腹腔注射生理盐水45 mg/kg,人参皂苷Rg1分别给10、20、40 mg/kg,阳性对照组尼莫地平1 mg/kg。采用大脑中动脉栓塞法制备局灶性脑缺血模型,神经功能缺损评分和TTC染色验证模型是否成功;采用免疫组织化学法和蛋白免疫印迹法检测大脑皮质缺血后PARP-1、TNFR1的表达。结果单纯缺血组较假手术组可见明显神经功能缺陷症状及大面积苍白色梗死区域;人参皂苷Rg1各组和阳性对照组神经功能评分和脑梗死体积百分比高于假手术组,低于单纯缺血组(P<0.05);人参皂苷Rg1各组与阳性对照组差异无统计学意义。人参皂苷Rg1低组每高倍视野PARP-1、TNFR1阳性细胞数高于假手术组和阳性对照组;中、高组高于假手术组,低于单纯缺血组(P<0.05)。单纯缺血组皮质PARP-1、TNFR1较假手术组阳性表达条带显著增强;人参皂苷Rg1低组PARP-1、TNFR1阳性表达高于假手术组;中组高于假手术组,低于单纯缺血组;高组低于单纯缺血组(P<0.05)。结论人参皂苷Rg1对大鼠局灶性脑缺血具有保护作用,其机制可能与下调大脑组织PARP-1、TNFR1的表达,对抗脑细胞坏死有关。

犬黑皮质素受体4真核表达载体的构建及表达

[目的]构建带myc和His标签的犬黑皮质素受体4真核表达载体并在MDCK细胞中进行表达。[方法]以犬MC4R基因组DNA为模板PCR扩增目的基因编码区,将扩增产物进行T-A克隆;酶切、测序鉴定成功后将目的基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A。重组体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R经酶切和测序鉴定;采用FuGENE HD介导转染技术将重组体导入MDCK细胞;转染后继续培养72 h,提取细胞内总RNA,RT-PCR鉴定目的基因的表达;提取细胞总蛋白,Western Blot检测蛋白表达。[结果]构建带标签的pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R重组真核表达载体,测序结果与GenBank公布的序列相似性为99%。RT-PCR和Western Blot检测到目的基因表达。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A-MC4R,重组体能在MDCK细胞中表达。

肥胖MC4R重组腺病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建黑素皮质素受体-4(MC4R)重组腺病毒表达载体,为肥胖症的基因治疗研究奠定基础。方法 PCR扩增犬MC4R目的基因后与T载体连接,双酶切鉴定正确的T-A载体获得具有黏性末端的MC4R目的基因;将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,构建穿梭载体pShuttle-CMV/MC4R;PmeⅠ单酶切pshuttle-CMV/犬MC4R后,转化到含pAdeasy-1的BJ5183感受态细胞,采用细菌内同源重组法构建腺病毒载体pAdeasy-1/pshuttle-CMV/MC4R;筛选阳性克隆子;PacⅠ酶切鉴定。结果线性化的pShuttle-CMV/MC4R转化含pAdeasy-1的BJ5183感受态细胞,16 h后获得阳性克隆子,经PacⅠ酶切鉴定出一大于20 kb的大片段和3.0 kb的特征性片段,通过BglⅡ、XhoⅠ双酶切切下约1000 bp的片段,含MC4R目的基因的重组腺病毒载体构建成功。结论细菌内同源重组法可高效、快捷的制备含犬MC4R的重组腺病毒载体;该载体为人类肥胖症的基因治疗研究奠定了基础。

杜氏肌营养不良症(DMD)及其动物模型研究进展

杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)属于X连锁隐性遗传病。DMD基因是人类最大基因,突变机制复杂。随着分子生物学的研究进展,对DMD的基因和其编码的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)及抗肌萎缩蛋白相关蛋白(utrophin)的认识不断深入。本文就DMD的病理学特点,Dys基因结构、表达、功能,DMD突变及其相关检测技术,DMD实验动物模型及相关治疗的研究进展进行综述。

犬黑素皮质素受体-4裸质粒注射促进小鼠肥胖的研究

[目的]探讨犬黑素皮质素受体-4(MC4R)cDNA的重组真核表达质粒对小鼠肥胖的影响。[方法]3次尾静脉高压注射pcDNA3.1-myc-His/A-MC4R质粒,RT-PCR成功验证小鼠体内犬MC4R表达后,适时监测每只小鼠的体重,同窝小鼠相互对照,利用两两比较的秩和检验进行统计学分析。另外,用脂肪组织病理切片分析小鼠皮下脂肪细胞变化。[结果]试验得出,小鼠体重变化有统计学意义;饲养时间相同、相互对照组的每一组小鼠脂肪细胞直径对比明显,且具有统计学意义。[结论]犬MC4R基因在小鼠体内表达,能促进小鼠体重增加,为犬MC4R调节肥胖机制的研究提供理论依据。

DMD模型小鼠基因突变及肌肉亚型表达特点研究

目的研究C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J模型小鼠子代基因突变情况及肌肉亚型的表达差异。方法选取2、3和4周龄C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J模型小鼠及C57BL/6J小鼠各3只,分别采集膈肌、背阔肌和腓肠肌的肌肉组织,利用RT-PCR方法扩增分析Dmd基因的结构特点;采用Westernbolt方法分析β-dystroglycan的表达差异。结果模型小鼠基因编码抗肌萎缩蛋白基因(Dmd)的第3202位点出现C→T的自发突变,模型小鼠β-dystroglycan的表达比正常鼠有显著性升高。结论C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J模型小鼠的肌纤维在发育中出现断裂或是缺失,β-dystroglycan表达大幅度上调。