猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白纳米抗体的筛选及其对病毒复制的抑制效应

为获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5蛋白的特异性纳米抗体,并探究其对病毒复制的抑制效应。使用原核表达系统将PRRSV-GP5蛋白大量表达后经镍柱亲和层析法纯化,使用所获的重组GP5蛋白免疫羊驼,并于第0、14、28、42天时采血,检测羊驼体内抗体效价后分离全血淋巴细胞,提取细胞总RNA,反转录后使用巢式PCR扩增出重链抗体可变区(VHH)片段,并与pCANTAB-5E载体相连后转化入TG1感受态细胞,利用噬菌体展示技术构建GP5-VHH噬菌体抗体展示文库。经连续三轮特异性噬菌体的筛选与富集后,淘选出与PRRSV-GP5蛋白高结合力的纳米抗体,通过间接ELISA方法鉴定其反应原性,后将所获的纳米抗体基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,利用Lipofectamine3000转染至Marc^(-1)45细胞内,与PRRSV分别共孵育0、24、36、48、60、72 h,以探究所筛针对PRRSV-GP5蛋白的纳米抗体于胞内对病毒复制与转录产生的影响。结果表明,成功对PRRSV-GP5蛋白进行原核表达并纯化,得到浓度为2.16 mg·mL^(-1)的重组蛋白,对羊驼三次免疫14 d后,其体内抗体效价高达1∶819200,构建GP5-VHH噬菌体抗体展示文库,库容量达2.93×107 CFU·mL^(-1),插入率为98%。经对噬菌体抗体文库连续三轮淘选富集后,最终获得2株不同氨基酸序列的纳米抗体。间接ELISA结果显示,2株纳米抗体均与PRRSV-GP5蛋白具有良好的亲和力。将2株纳米抗体转染至Marc^(-1)45细胞内,它们分别于36与60 h时显著阻碍PRRSV的复制与转录,展现出了较好的阻碍病毒复制的能力。本研究首次筛选出针对PRRSV-GP5蛋白的特异性纳米抗体,且经验证所筛纳米抗体具备抑制PRRSV在细胞内复制的能力,研究结果为抗PRRSV新型药物的研发奠定了试验依据与物质基础。

哈萨克马不同发育阶段睾丸组织学观察与分析

【目的】对雄性哈萨克马四个发育阶,即马驹、周岁马、3岁马和5岁以上马的睾丸组织进行组织学观察与分析,了解不同阶段睾丸组织的特点,为种公马的科学管理和使用提供理论依据。【方法】采用石蜡组织切片制作技术和显微观察的方法。【结果】随着马的发育成熟,马的睾丸组织体积逐渐增大,睾丸组织曲精细管的直径也依次增加。幼驹的睾丸组织尚未发育完整,为睾丸索。周岁马的曲精细管已经形成,但是生殖细胞的发育还不完全。比较3岁马和成年马的睾丸大小,曲精细管和曲精细管内的生殖细胞的数量,3岁马的睾丸体积接近成年马,但是睾丸的宽度和长度略小于成年马(P<0.05)。3岁马曲精细管的直径和细管内的精子数也略小于成年马,但差异不显著(P>0.05),精子细胞数目之间也无显著差异(P>0.05)。【结论】新疆哈萨克公马在生产中选择4岁以上的公马做种用是科学和合理的。

哈萨克马不同发育阶段睾丸组织学研究

【目的】研究对雄性哈萨克马四个发育阶段,即马驹、周岁马、3岁马和5岁以上马的睾丸组织进行组织学观察与分析,了解不同阶段睾丸组织的特点,为种公马的科学管理和使用提供理论依据。【方法】采用石蜡组织切片制作技术和显微观察的方法。【结果】随着马的发育成熟,马的睾丸组织体积逐渐增大,睾丸组织曲精细管的直径也依次增加。幼驹的睾丸组织尚未发育完全,为睾丸索;周岁马的曲精细管已经形成,但是生殖细胞的发育还不完全。比较3岁马和成年马的睾丸大小以及曲精细管和曲精细管内的生殖细胞的数量,3岁马的睾丸体积接近成年马,但是睾丸的宽度和长度略小于成年马(P<0.05)。3岁马曲精细管的直径和细管内的精子数也略小于成年马,但差异不显著(P>0.05),精子细胞数目之间也无显著差异(P>0.05)。【结论】新疆哈萨克公马在生产中选择4岁以上的公马做种用合理的。

不同年龄马睾丸组织中miRNA-34家族含量的变化

为研究microRNA(miRNA)-34家族在马不同发育阶段睾丸组织内的表达规律,应用实时荧光定量PCR方法,以GAPDH作为内参基因,分别对miRNA-34家族(miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34c)在3个发育阶段哈萨克马睾丸组织表达情况进行检测。结果表明miRNA-34a在马睾丸发育过程中表达量较为稳定,在不同发育阶段睾丸组织内无显著差异(P>0.05)。miRNA-34b和miRNA-34c在马驹和周岁马睾丸组织中的表达量较低,在这两个年龄段表达量无显著差异(P>0.05)。而在成年马阶段出现明显上升,成年马miRNA-34b和miRNA-34c表达量与马驹和周岁马表达量有极显著的差异(P<0.01)。位于同一基因簇上的miRNA-34b和miRNA-34c具有极为类似的表达模式和结构,分析认为马的miRNA-34b和miRNA-34c也具有冗余功能。

胸膜肺炎放线杆菌血清8型自转运黏附素基因的克隆测序及功能预测分析

为研究胸膜肺炎放线杆菌(APP)三聚体自转运黏附素(TAAs)的功能,以GenBank登录的APP血清5b型自转运黏附素基因5'端的3875bp序列设计引物,通过PCR的方法首次获得APP血清8型运黏附素N端的基因序列片段,测序结果与已知血清型的基因序列和氨基酸推导序列分别进行比对,结果表明与血清7型自转运黏附素N端同源性达到93%,氨基酸推导序列同源性达到97%;与血清5b型自转运黏附素N端同源性达到92%,氨基酸推导序列同源达到100%。经软件分析获得的序列含有与细菌的黏附、聚集和侵入密切相关的Hep_Hag基序,应用马克斯-普朗克研究所的在线分析TAAs的基序和蛋白域的软件daTAA,进行预测并证明所得序列为TAAs,并且具有完整的N段头部序列,有重要功能区具有良好的抗原性。比对的结果为寻找研究APP的定植基序和毒力因素提供了重要基础。

地方优良牛种——阿勒泰白头牛

阿勒泰白头牛以具有早熟、繁殖能力强、生长发育快、耐高寒、耐高温、耐粗饲、适应性好和抗病能力强等优良特性而深受新疆广大农牧民青睐。它还具有较好的生产能力，肉质嫩，乳脂率高，体型美观，性格温驯，是一种古老而原始的地方优良牛种。

新疆地区不同绵羊品种支原体肺炎血清学调查

为了调查新疆地区规模化羊场不同品种绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae of sheep,MO)的感染情况,本研究利用绵羊肺炎支原体(Sheep Mycoplasma pneumoniae,MP)ELISA检测试剂盒,对新疆南疆巴音郭楞蒙古自治州(巴州)和北疆伊犁哈萨克自治州(伊犁)的4个绵羊品种共1628只未免疫羊只的血清样本进行了绵羊肺炎支原体抗原和抗体检测。结果显示,两个地区不同绵羊品种均存在MO感染。伊犁地区绵羊MP-抗原(Ab)阳性率为20.29%、MP-抗体(Ab)阳性率为16.62%,其中哈萨克羊MP-Ag阳性率为20.04%、MP-Ab阳性率为23.22%;萨福克羊MP-Ag阳性率为20.61%、MP-Ab阳性率为8.30%。巴州地区绵羊MP-Ag阳性率为14.42%,MP-Ab阳性率为14.65%,其中巴音布鲁克羊MP-Ag阳性率为17.91%、MP-Ab阳性率为18.65%,杜泊羊MP-Ag阳性率为11.08%、MP-Ab阳性率为11.08%;萨福克羊MP-Ag阳性率为14.70%、MP-Ab阳性率为13.23%。血清学结果表明,绵羊支原体感染在新疆南疆巴州地区和北疆伊犁地区的规模化羊场的不同绵羊品种中均普遍发生。不同地区不同绵羊品种中绵羊支原体肺炎抗原检出阳性率无显著差异,新疆本地绵羊品种绵羊支原体肺炎抗体检出阳性率显著高于同一地区的外来引进品种。本研究为评估绵羊肺炎支原体在新疆的流行情况以及制定有效的防治措施提供了参考依据。

布鲁菌Omp31的单克隆抗体在流式细胞术中的初步应用

目的利用布鲁菌Omp31的单克隆抗体,初步建立布鲁菌抗原流式细胞术(FCM)检测方法,分析该方法在人布鲁菌病(简称布病)临床样本检测中的价值。方法牛种布鲁菌2308、104M、S19,羊种布鲁菌M5-90和猪种布鲁菌S2共5个菌株,经超声破碎,获得其菌液上清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法和蛋白免疫印迹法(Western blot),检测已制备的抗布鲁菌Omp31单克隆抗体5H3对上述5个菌株的识别能力。构建Omp31重组真核表达载体(pcDNA3.1-Omp31)并转染人胚肾细胞(293FT细胞),Western blot检测Omp31蛋白的表达。羊种布鲁菌弱毒疫苗株M5-90侵染人急性单核细胞白血病细胞系(THP-1细胞),构建含菌单核吞噬细胞。将5H3抗体用异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)标记,采用FCM,利用FITC-5H3抗体检测pcDNA3.1-Omp31转染293FT细胞和含菌单核吞噬细胞,鉴定该抗体对细胞内布鲁菌抗原的识别能力,初步建立FCM的检测方法,并测定FITC-5H3抗体在FCM中的灵敏度。利用双抗体(PE-5H3和FITC-CD14)的流式细胞染色测定人外周血单个核细胞(PBMCs),分析该方法应用于人布病临床检测的可行性。结果抗布鲁菌Omp31单克隆抗体5H3不仅能识别羊种布鲁菌M5-90菌株和猪种布鲁菌S2菌株,还能识别缺失Omp31基因的牛种布鲁菌2308、104M、S19菌株。FITC-5H3抗体可用于流式细胞染色识别细胞内的布鲁菌抗原,表达Omp31的293FT阳性细胞比例约为59.3%,疫苗株M5-90侵染的THP-1阳性细胞比例约为6.2%,检测293FT阳性转染细胞的灵敏度为4%。初步建立了基于PE-5H3和FITC-CD14的双抗体染色的FCM检测方法,该方法检测布病患者PBMCs中的双抗体阳性细胞比例(1.93%)高于健康人群(<0.30%,阴性)。结论利用FCM,初步建立了荧光素标记抗布鲁菌Omp31单克隆抗体5H3检测细胞内布鲁菌抗原的方法,并发现5H3抗体能识别牛种布鲁菌,弥补了布鲁菌抗原检测中Omp31的应用缺陷。此方法的建立为布病病原学检测方法的研究提供了新策略,为检测试剂的开发提供了新材料。