HHV-8感染与PI3K/Akt/mTOR信号转导通路研究进展

近年研究表明，PI3K/Akt／mTOR信号转导通路是细胞内重要的信号转导通路，脂类激酶PBK和它的下游靶点Akt，即蛋白激酶B，在各种酪氨酸激酶受体诱导的致癌信号通路中发挥了重要的作用。PBK／Akt信号通路的成分在人类大多数恶性肿瘤中都发生了改变，尤其在卡波肉瘤的增殖、存活和抵抗凋亡、血管发生中发挥了重要作用。人类8型疱疹病毒（HHV-8）可通过激活PBK-Akt／PKB／mTOR信号转导通路抑制感染细胞的凋亡，从而维持病毒在人体内的感染和生存。本文就HHV-8与PBK-Akt／PKB信号转导通路的关系及在卡波肉瘤发生、发展中的可能机制作一综述。

细胞穿膜肽pep-1与vMIP-Ⅱ的融合表达与纯化

细胞穿膜肽是一类能携带大分子物质进入细胞的短肽,其穿膜能力不依赖经典的胞吞作用。本研究构建了含有细胞穿膜肽pep-1和病毒巨噬细胞炎症蛋白-Ⅱ(viral macrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ)的融合表达质粒pET15b-pep-1-vMIP-Ⅱ,并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS中经IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定出可溶性的融合蛋白pep-1-vMIP-Ⅱ。通过对IPTG浓度、温度等诱导表达条件进行优化,确定在IPTG浓度为0.2mmol/L、28℃下诱导7h可溶性蛋白的表达量相对较高,经Ni-NTA亲和层析,超滤除盐纯化获得高纯度的融合蛋白pep-1-vMIP-Ⅱ,将该蛋白作用于Hela细胞,激光共聚焦显微镜观察结果显示该融合蛋白能够携带目的基因穿透细胞膜。本文结果将为进一步研究vMIP-Ⅱ的功能和细胞穿膜肽技术的应用奠定基础。

三磷酸腺苷结合盒转运体A1蛋白第二跨膜结构域缺失突变体的构建及其抗砷性研究

目的检测三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)蛋白第2跨膜结构域(the second transmembrane domain,TMD2)中关键的抗砷结构域。方法采用重叠区扩增基因拼接法构建三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因TMD2的一系列缺失突变体,分别转染至HeLa细胞,激光共聚焦观察其定位,Cell Counting Kit-8检测48 h急性砷中毒后生存率的变化,原子荧光吸收光谱法检测细胞内的总砷含量。结果激光共聚焦证实各突变体的编码蛋白均定位在HeLa细胞的细胞膜上。CCK-8结果显示,转染胞外第4、5环,胞内第4、5环缺失突变体的HeLa细胞IC50分别为33.18、32.84、33.45、34.29μmol.L-1,与转染野生型三磷酸腺苷结合盒转运体A1质粒的HeLa细胞(IC50为33.96μmol.L-1)无显著差异,均高于空载体转染对照组(IC50为19.01μmol.L-1)。转染胞外第6环缺失突变体HeLa细胞的IC50为19.95μmol.L-1,与空载体对照组无显著差异,显著低于野生型三磷酸腺苷结合盒转运体A1质粒转染组。原子荧光分光光度法结果显示,转染胞外第6环缺失三磷酸腺苷结合盒转运体A1的HeLa细胞内砷含量与转染空载体接近,而转染其他突变体的结果与转染野生型三磷酸腺苷结合盒转运体A1的结果基本一致。结论成功构建了5个三磷酸腺苷结合盒转运体A1蛋白第2跨膜结构域的缺失突变体,且其表达的蛋白仍然正确定位于HeLa细胞的细胞膜上。突变体(除胞外第6环外)仍然具有一定的抗砷性,提示三磷酸腺苷结合盒转运体A1胞外第6环可能是关键抗砷结构域。

细胞穿膜肽融合蛋白PEP1-vMIP-Ⅱ促进血管增生研究

目的构建细胞穿膜肽PEP-1与vMIP-Ⅱ融合基因的表达质粒,原核表达、纯化并鉴定PEP1-vMIP-Ⅱ融合蛋白,鉴定该蛋白的穿膜功能,研究其对血管增生相关基因表达的影响。方法将化学合成的细胞穿膜肽PEP1和vMIP-Ⅱ基因克隆到原核表达载体pET15b,构建pET15b-pep-1-vMIP-Ⅱ质粒。表达纯化后,Western-blot鉴定蛋白,荧光共聚焦显微镜观察融合蛋白的穿膜功能。Real time PCR检测该蛋白作用对HMEC-1细胞内血管增生相关基因表达的改变。结果 DNA测序和酶切结果鉴定了pET15b-PEP1-vMIP-Ⅱ载体构建正确,Western blot鉴定纯化的融合蛋白PEP1-vMIP-Ⅱ与所预测相对分子质量相符。激光共聚焦显微镜检测到该蛋白能够进入细胞,在HMEC-1细胞内上调了促血管增生基因VEGFA和VEGFC的表达。结论成功构建了pET15b-PEP1-vMIP-Ⅱ载体,表达纯化的PEP1-vMIP-Ⅱ融合蛋白具有穿透细胞膜的功能,且能显著上调促进血管增生基因VEGFA和VEGFC的表达。

ABCA1胞外第四环缺失突变体的构建及其抗砷性初步研究

目的:构建ABCA1细胞外第四环第1479～1597位氨基酸残基缺失的突变体。方法:采用重叠区扩增基因拼接法构建ABCA1第1479～1597位氨基酸残基缺失的突变体基因,并将其克隆至pcDNA3.1/V5-His/ABCA1重组载体上,脂质体法转染Hela细胞,激光共聚焦观察突变体定位,Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒检测其48h急性砷中毒后生存率的变化。结果:该突变体基因经DNA序列分析表明其具有正确的序列和阅读框。激光共聚焦证实其表达的蛋白仍然能正确定位在Hela细胞的细胞膜上。CCK-8结果显示转染重组质粒和突变体质粒的细胞在各种砷浓度下生存率都较空载体组高。结论:成功构建了ABCA1胞外第四环第1479～1597位氨基酸残基缺失的突变体,且其表达的蛋白仍然定位于细胞膜上,突变体仍然具有一定的抗砷性,提示ABCA1胞外第四环可能不是关键抗砷结构域。