小拟南芥HDG12基因的克隆、生物信息学分析及植物表达载体的构建

以小拟南芥基因组DNA为模板，运用同源克隆法获得小拟南芥HDG12基因，命名为ApHDG12。运用生物信息学方法，对ApHDG12基因的理化性质、保守序列、二级结构、亚细胞定位等进行了分析，并进行同源建模。经测序和生物信息学软件预测分析，结果显示，ApHDG12基因由10个外显子和9个内含子组成，mRNA长度为2064 bp，编码687个氨基酸，亚细胞定位于细胞核。系统进化树显示ApHDG12与Capsella rubella遗传距离最近，CDD保守序列分析结果显示ApHDG12有18～79位的同源异型域和206～436位的START结构域，属于HD－zipⅣ类基因家族，同时构建了植物表达载体pBI121：HDG12，转化到农杆菌GV3101中，为进一步研究基因功能奠定基础。

不同浓度烯效唑与胺鲜脂复配剂浸种对玉米幼苗抗旱性的影响

用不同质量浓度烯效唑、胺鲜脂配比的复配剂对玉米种子‘郑单958’进行12h及24h的浸种处理,测定玉米的发芽情况、幼苗形态指标以及干旱胁迫下玉米幼苗叶片的相对含水量、相对电导率、丙二醛浓度、过氧化氢酶活性、叶绿素质量分数。结果表明,当40mg/L烯效唑、50g/L胺鲜脂配比下浸种24h时,显著抑制玉米种子的芽长,但对玉米种子的发芽率影响不大,促进幼苗壮苗的形成;对干旱的抗性响应因浸种时间不同而异,在浸种12h时,不同质量浓度烯效唑、胺鲜脂配比的混合剂中烯效唑质量浓度高效果优于质量浓度低的处理,而在浸种24h时,烯效唑质量浓度低效果反而优于质量浓度高的处理。通过形态及生理指标的测定,已明确40mg/L烯效唑、50g/L胺鲜脂的配比质量浓度进行浸种处理24h对玉米有较好的壮苗效果及提高植物抗逆性的作用。

新陆早42号体细胞胚发生和植株再生

以新陆早33号为对照研究新疆主栽品种新陆早42号的体细胞胚胎发生。研究表明,所用4种激素组合均能有效诱导愈伤组织,但二者仅在经过IBA 1.0 mg.L-1+KT 0.5 mg.L-1和2,4-D 0.1 mg.L-1+KT 0.1 mg.L-1两种激素组合诱导初生愈伤后,才能胚胎发生。新陆早42号在IBA 1.0 mg.L-1+KT 0.5 mg.L-1培养基上46 d就开始胚胎发生;新陆早33号则不能直接胚胎发生,需继代到MSBP培养基上培养48 d才有胚胎发生。经2,4-D 0.1 mg.L-1+KT 0.1 mg.L-1组合培养的愈伤均需要继代到MSBP培养基上培养才能胚胎发生,新陆早42号和新陆早33号胚胎发生的最早时间分别是71 d和81 d。胚性愈伤在铺有滤纸的MSBF培养基上分化成胚并发育成再生植株。新陆早42号在140 d有根系发育良好的能嫁接植株(株高7～8 cm),而新陆早33需180 d。即成功建立了新陆早42号的再生体系,且其胚胎发生能力和再生能力均优于对照。

亚洲棉和雷蒙德氏棉PEBP家族基因的鉴定及该家族基因在陆地棉组织中表达分析

磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidyl ethanolamine-binding proteins,PEBP)基因家族广泛存在于真核生物中,在被子植物中主要起着促进或抑制开花和控制株型的作用。利用亚洲棉(Gossypium arboreum,A2)和雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii,D5)的基因组数据库,分别搜索到8个棉花PEBP同源基因,都包含4个外显子和3个内含子,编码的蛋白都存在PEBP家族的保守基序和关键氨基酸位点,表明二倍体棉花中至少存在8个PEBP家族基因。进化分析表明,8个PEBP基因分属于3个亚家族,含FLOWERING LOCUS T(FT)-like亚家族1个、TERMINAL FLOWER 1(TFL1)-like亚家族5个(包括3个TFL1和2个BFT)、MOTHER OF FT AND TFL1(MFT)-like亚家族2个。实时荧光定量PCR分析陆地棉(Gossypium hirsutum)8个PEBP基因在根、茎、叶、幼苗顶端分生组织、花、胚珠和25 d的纤维组织中的表达,表明FT1在叶片中表达量最高,其次在纤维、胚珠和花中;MFT1在各组织中均表达,但在纤维中表达量最高,其次是花和叶片中,而MFT2以在叶片中表达为主;TFL1a、TFL1b和TFL1c均在根中表达量最高,但TFL1c在叶片、花和胚珠中也有相对较高的表达;BFT1和BFT2在叶片中表达量最高,但除幼苗顶端分生组织外,BFT1在其他各组织中的表达明显高于BFT2。这些结果表明,PEBP家族基因在棉花的生长发育中可能具有不同的功能。

黄瓜正常品种及一个芽黄突变体的核型分析

对黄瓜(Cucumis sativus L.)6个正常品种和1个芽黄突变体的根尖细胞染色体进行计数,并对其核型进行了分析。结果表明,正常黄瓜与芽黄突变体黄瓜的染色体数目均为2n=14,属于二倍体植物,染色体基数为7。芽黄突变体的染色体核型公式与正常黄瓜品种长春密刺(C.sativus cv.Changchunmici)、津研4号(C.sativus cv.Jinyan No.4)、津优2号(C.sativus cv.Jinyou No.2)、津优3号(C.sativus cv.Jinyou No.3)、农城3号(C.sativus cv.Nongcheng No.3)、新泰密刺(C.sativus cv.Xintaimici)的染色体核型公式一致,均为2n=14=12m+2sm;核型不对称系数为55.49%～57.45%,核型类型均为1A型,属对称核型。在系统演化上,黄瓜可能属于较原始的种类。通过对不同黄瓜材料间的染色体长度进行方差分析,结果P>0.05,说明在染色体水平上芽黄突变体与正常的黄瓜几乎没有区别。

海岛棉DELLA蛋白基因GbGAI2的克隆及其在胚珠中表达分析

赤霉素(Gibberellins,GA)在棉花纤维的发育过程中起重要作用,DELLA蛋白是GA信号通路中的起关键作用的负调控因子。本研究采用同源克隆方法,获得了海岛棉的DELLA蛋白同源基因GbGAI2。序列比对分析结果表明,GbGAI2编码的氨基酸序列具有DELLA蛋白的典型结构域,并与陆地棉DELLA蛋白GhGAI2氨基酸有90.13%相同。半定量RT-PCR分析结果表明,GbGAI2在1-5DPA和23DPA棉胚中的表达量较高,说明该基因可能在海岛棉棉纤维发育的起始阶段和棉纤维次生壁加厚阶段起作用。

棉花GhGAI3a DELLA功能域缺失过表达载体的构建及其功能初步分析

本研究对棉花GhGAI3aDELLA功能域缺失片段的克隆及对其功能进行了初步分析。本文以质粒p121GhGAI3aDNA为模板,通过PCR方法获得基因GhGAI3aN端赤霉素响应关键区域DELLA缺失的片段Gh-gai3a,构建出过量表达载体pBP35S:gai3a。利用农杆菌介导滴花法转化拟南芥获得T1代转基因植株。DNA检测结果显示,获得了24个转基因株系,RT-PCR表明了该基因在部分株系中已有表达。初步的表型观察发现该DELLA区缺失基因严重影响花器官、侧枝的发育,抑制植物的生长。

拟南芥At3g28220基因抗寒功能初步分析

采用RT-PCR分析、基因克隆、转化等方法对At3g28220基因功能进行了研究。结果发现At3g28220基因在拟南芥受到低温及盐胁迫时才会在拟南芥中表达,且在不同生长期不同器官中的表达量无明显差异。通过构建35s:At3g28220基因正反向表达载体转化拟南芥,T1植株经卡那霉素抗性筛选,RT-PCR检测,结果表明At3g28220基因已经整合到拟南芥基因组中,并在转录水平表达。正常生长条件下,转基因拟南芥与野生型拟南芥的生长未见明显区别,而经过低温胁迫研究发现,正向表达转基因拟南芥的冷冻耐受能力明显高于野生型植株。说明拟南芥hos10-1冷驯化能力的丧失是与At3g28220基因的表达下调有直接的关系。

棉花黄萎病菌毒素诱导植株产生抗病性的机理

提取新疆棉花黄萎病菌毒素,用不同浓度棉花黄萎病菌毒素处理棉花种子,通过棉苗可溶性物质含量、过氧化氢酶活性以及叶绿素含量的变化研究毒素对棉苗生理代谢的影响,以初步研究棉花黄萎病菌毒素诱导棉花植株产生抗病性的机理。

天山雪莲再生体系的优化及转sikPIP2;7基因的研究

以天山雪莲幼苗叶片为外植体进行再生体系的优化,经农杆菌介导法转化获得转正义sikPIP2;7雪莲植株,对转基因雪莲苗进行低温处理并进行抗逆分析。结果表明,诱导不定芽最佳植物激素组合为MS+0.5mg/L ZT+1.0mg/L NAA;生根阶段活性炭最佳添加量为0.5g/L,蔗糖最佳添加量为20g/L。RTPCR分析表明,在0℃胁迫下转基因植株sikPIP2;7表达量增加;低温胁迫下转基因植株丙二醛(MDA)质量摩尔浓度、相对电导率(REC)、过氧化氢(H2O2)清除速率和超氧化物岐化酶(SOD)活性显著优于对照植株,说明sikPIP2;7过表达提高转基因雪莲抗低温胁迫的能力。

蔗糖转运蛋白VvSUC11和VvSUC12累加作用对提高转基因甜菜含糖量的影响

【目的】甜菜是重要的糖料作物,块根中的蔗糖含量是其品质的决定因子。利用基因工程技术将葡萄蔗糖转运蛋白基因(VvSUC11和VvSUC12)导入甜菜块根中,以了解蔗糖转运蛋白是否能提高甜菜的含糖量。【方法】利用葡萄蔗糖转运蛋白基因VvSUC11和VvSUC12构建的根特异性表达植物双价表达载体(pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12),通过农杆菌介导法转化到甜菜(Beta vulgaris L.)品种KWS-9103中。利用PCR和RT-PCR技术检测目的基因是否整合到甜菜中并表达。将获得的转基因甜菜和对照甜菜生根后移栽大田,对其叶片性状、相关的生理指标、块根重和含糖量进行测定。【结果】通过PCR和RT-PCR检测,获得13株转基因甜菜。测得转基因植株叶长、叶宽、叶柄长和叶片数量平均分别为25.16 cm、19.31 cm、29.17 cm和38.33个,与对照相比,叶宽增加31.81%,叶柄缩短16.61%,叶片数目增加17.04%,都存在极显著差异,而叶长增加1.68%,无显著差异;叶绿素a含量(1.31 mg·g-1)、叶绿素b含量(0.562 mg·g-1)和叶绿素总含量(1.87 mg·g-1)与对照无显著差异;叶中可溶性糖含量(14.59 mg·g-1)降低13.04%,与对照(16.51 mg·g-1)存在极显著差异,叶柄中可溶性糖含量(21.90 mg·g-1)增加3.36%,但与对照(21.6 mg·g-1)差异不显著;单株转基因甜菜的块根重和含糖量分别平均为3.067 kg和183.2 g·kg-1,与对照(2.894 kg)相比,块根增重5.91%,差异不显著,含糖量增加9.41%,与对照(167.5 g·kg-1)存在显著差异。说明转基因甜菜叶面积和叶片数的增加,扩大了其光合叶面积,同时叶柄缩短有利于提高糖分子从源叶到库的转运,促进甜菜块根的形成和加快糖分的积累。【结论】利用蔗糖转运蛋白VvSUC11、VvSUC12能够有效地提高转基因甜菜的含糖量。

棉花DELLA蛋白GhGAI4b基因的克隆及功能初步分析

【目的】DELLA蛋白已在不同的物种中被广泛鉴定,并且功能区高度保守,是GA信号通路中的负调控因子,在棉花纤维细胞起始和发育中起重要的作用。研究棉花中DELLA基因的功能。【方法】从棉花中克隆DELLA蛋白的同源基因GhGAI4b,构建35S:GhGAI4b植物过量表达载体,通过农杆菌侵染花序的方法转入野生型拟南芥中,观察转基因植株的表型。【结果】序列分析表明GhGAI4b全长开放阅读框1 617 bp,编码538个氨基酸,具有DELLA蛋白的典型结构域。采用Clustal X将GhGAI4b的氨基酸序列与其他已知的DELLA蛋白氨基酸序列进行相似性比对,发现GhGAI4b氨基酸序列与陆地棉、拟南芥的相似性较高,达到47%以上。转基因株系表现出叶片颜色深绿,叶片缩小且肥厚,叶片细长呈锯齿状;有些株系会出现多重莲座叶,雄蕊发育不全,晚花,株高变矮等赤霉素不敏感突变体的表型。【结论】过表达GhGAI4b能够抑制拟南芥莲座叶的生长和发育,影响转基因拟南芥花器官的发育,严重时引起转基因拟南芥的不育。

烯效唑和胺鲜酯在玉米上的调控效果及机理研究

为探明最佳时期、最适浓度的复配剂对玉米的的调控效果及机理,本研究以郑单958为材料,以不同浓度烯效唑和胺鲜酯的复配剂在生育期不同阶段对叶面喷施,分析测定了玉米各时期的农艺性状、光合指标、产量、籽粒品质以及籽粒内源激素含量。结果表明:在拔节期进行叶面喷施,40 mg/L烯效唑复合50 g/L胺鲜酯配比复配剂在抑制玉米植株高度、增大茎秆粗度、增加叶面积方面有明显作用,同时其产量提高。拔节期喷施40 mg/L烯效唑复合50 g/L胺鲜酯配比复配剂复配剂有较高的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间二氧化碳浓度(Ci)及蒸腾速率(Tr),有助于后期籽粒的灌浆,且明显改善了玉米籽粒的品质,显著提高了玉米籽粒的粗蛋白、可溶性蛋白、赖氨酸、可溶性糖、粗淀粉的含量。拔节期叶面喷施烯效唑与胺鲜酯复配剂,随着籽粒生育进程的推进,IAA、GA3和ZT含量有所增加,ABA含量大幅度提高;且不同浓度处理时,同类激素随时间变化的总体趋势存在很大差异。综上所述,40 mg/L烯效唑复合50 g/L胺鲜酯配比复配剂可为生产中采用化控技术控制植株的生长,实现玉米矮化密植提供了技术支持与理论依据。

油葵脂肪酸去饱和酶基因HaFAD2-1的克隆与功能鉴定

为研究油葵FAD2-1基因在脂肪酸合成中的催化功能,利用RT-PCR技术,从油葵品种新葵杂4号未成熟种子中克隆HaFAD2-1基因的全长cDNA序列。将该基因序列构建穿梭表达载体pYES2-HaFAD2-1,并转化到营养缺陷型酿酒酵母菌株INVSc1中。将重组酵母诱导培养后对其总脂肪酸进行GC-MS分析。结果显示,HaFAD2-1基因编码一个长378个氨基酸的脂肪酸去饱和酶蛋白,分子质量43 719,等电点(pI)为8.38,具有3个高度保守的组氨酸簇。脂肪酸甲酯气相色谱分析结果表明HaFAD2-1基因在酿酒酵母中获得表达,能将油酸转化为亚油酸,证明克隆得到的HaFAD2-1具有完整的催化功能。

大叶落地生根STM基因植物表达载体构建及烟草转化

为了研究大叶落地生根中(Kalanchoe daigremontiana)的KdSTM基因对侧芽的形成具有一定的促进作用。采用RT-PCR技术以大叶落地生根叶片边缘的小植株的总cDNA为模板,克隆得到KdSTM基因。KdSTM开放阅读框750 bp,编码249个氨基酸残基。为进一步研究该基因是否具有促进植物芽再生的作用,构建了p35S::KdSTM植物过表达载体,利用农杆菌介导将植物表达载体侵染烟草,转化植株经分子鉴定.成功获得转基因烟草植株。通过对转基因烟草试管苗和野生型试管苗的表型观察,发现二者的表型存在有很大的差异。转基因型烟草的叶片浓绿,早期出现较小分枝侧芽,而野生型未出现侧芽。本研究的结果表明克隆的大叶落地生根中KdSTM基因具有生物学活性,对侧芽的形成具有一定促进的作用。

棉花GhFTL1基因启动子的克隆及序列分析

棉花GhFTL1是开花相关的调控基因。为了解该基因的表达模式,通过染色体步移的方法从棉花基因组中分离到长度约为715bp的启动子片段。结果显示:该片段在起始密码子104bp处有1个典型的TATA box,预测的转录起始位点在起始密码子前69bp处,含有与光调节有关的元件,GT-1和SP1,另外存在逆境胁迫相关等的顺式作用元件。拟南芥的FT基因启动子上有CArG box,该基因可以促进植物早花,长春花TDC基因启动子上有与光调节有关的GT-1元件,分析此序列和拟南芥的FT、长春花的TDC等基因上的一些调节元件,发现它们有很大的相似性。结论:初步推断此序列可能是GhFTL1基因的启动子片段。

多元混菌培养对棉花黄萎菌拮抗效果的研究

特基拉芽胞杆菌C-9和鞘氨醇杆菌A1是分离得到的2株对棉花黄萎菌具有较好生防效果的菌株,平板对峙试验测定菌株C-9与A1的抑菌率分别为77.8%和83.3%,根据脂肽类抗生素相关合成基因序列进行PCR扩增,2株生防菌都能检测到surfactin、fengycin和mycosubtilins相关基因片段。通过单因素试验对液体混菌培养体系进行初步筛选,得到对棉花黄萎菌具有较好防效的最佳混菌比例A1:C-9=1:9,在此比例下的混菌培养物对棉花黄萎菌的抑制能力较单菌株A1和C-9提高了131%和36.7%。镜检发现混菌培养物抑制可致黄萎菌菌丝发生膨大畸形。盆栽试验表明,混菌培养物对棉花黄萎病的防治效果可达66.7%,混菌培养物处理的棉花在挑战接种棉花黄萎菌后,棉花体内防御酶系CAT酶活快速响应,在达到峰值时比同时期的CK组增加了135.3%。POD和SOD的基础酶活较CK分别提高22.5%和39.8%,且MDA含量始终低于CK。综合分析表明,混菌发酵可提高菌株对黄萎菌的抑制效果,可通过直接抑制黄萎菌生长和诱导植物产生防御反应来提高对棉花黄萎菌的抗性。

转大肠杆菌KatG基因烟草的获得及其抗逆性鉴定

以NC89烟草(N.tabacum)为材料,经农杆菌介导法转化烟草,通过PCR和RT-PCR对转化烟草进行鉴定,利用百草枯、PEG6000和NaCl处理烟草并进行抗性分析。结果表明,经不同浓度百草枯处理后,转基因烟草受伤害程度明显低于野生型,说明转KatG烟草的抗氧化性强于野生型烟草。与野生型植株相比,经不同质量浓度PEG6000和不同浓度NaCl处理后,转基因烟草叶片相对含水量、相对电导率、CAT活性、MDA质量摩尔浓度、PSⅡ相对量子产率均显著优于野生型植株,表明转KatG烟草的抗旱和抗盐性强于野生型烟草。说明大肠杆菌KatG基因具有提高植物抗逆的功能。因此,KatG基因在抗逆基因工程方面具有较好地应用前景,大肠杆菌KatG基因具有增强抗氧化的功能。

棉花G.LEC1A基因的克隆和鉴定

为了研究棉花LEC1基因的功能,本研究采用同源克隆方法从海岛棉中克隆棉花LEC1基因(G.LEC1A),构建p CAMG.LEC1A植物表达载体,用农杆菌蘸花法转化拟南LEC1缺失突变体lec1-1,通过干燥筛选方法检验LEC1功能恢复情况。结果表明:G.LEC1A基因的ORF全长为627 bp,编码208个氨基酸,具有LEC1蛋白家族保守的B结构域。组成型表达G.LEC1A可恢复拟南芥lec1-1突变体种子的干燥耐受性。研究结果说明,棉花LEC1A基因是拟南芥LEC1的同功基因。

新疆部分棉区棉花黄萎病病菌致病力分化的遗传多样性分析

以筛选出的特异性强、重复性好、多态性丰富的9条简单重复序列标记(simple sequence repeat,简称SSR)引物对新疆不同棉区致病力分化的46株棉花黄萎病病菌[大丽轮枝菌(Verticilium dahliae)]进行SSR分子检测,根据遗传多样性,并结合不同菌株的棉区区域来源、菌落培养类型以及致病力进行关联性分析。结果表明,遗传多样性与致病力分化没有相关性,遗传多样性较低的地区有更多的强致病力菌株。通过SSR分析发现,棉花黄萎病病菌遗传多样性与菌株棉区区域来源有一定的相关性,致病力检测结果显示,同一地区内和不同地区之间的黄萎病病菌致病力均出现了明显的分化现象。致病强的菌株以菌核型菌株为主,中等致病力和弱致病力菌株中也有菌核型菌株出现。