新疆石河子南瓜和加工番茄CMV卫星RNA与RNA3序列分析

为探究石河子地区侵染南瓜和加工番茄的CMV卫星RNA及基因组RNA3的分子变异及株系分化,从石河子蔬菜研究所采集南瓜和加工番茄样品并提取dsRNA,利用RT-PCR方法克隆5个CMV卫星RNA序列和2个CMV RNA3序列,南瓜样品卫星RNA及RNA3分别命名为N-sate和N-R322,片段大小分别为335nt和2 214nt;加工番茄样品卫星RNA及RNA3分别命名为To-9-sate、S18-1、S9、S18-2和To-9-R322,片段大小分别为381nt、396nt、334nt、334nt和2 216nt。卫星RNA序列分析结果显示,卫星RNA的序列差异与地域有一定的相关性,与寄主类别无关。同时这5个卫星RNA序列都不含有CMVYSAT所具有的黄化区域。N-R322和To-9-R322序列分析结果显示,二者均属于CMV亚组ⅠB,且CMV分离物有一定的地域相关性,没有明显寄主相关性。

大学生创新性实验计划实施过程管理实践与分析

实践教学是培养学生创新能力的重要组成部分。"大学生创新性实验计划"的实施对于高校本科生的学习主动性和创造性,增强学生的创新精神、创新能力和综合素质具有重要作用。结合石河子大学生命科学学院的人才培养目标,以及生物科学和生物技术专业的特点,对开展"大学生创新性实验计划"管理过程中存在的问题进行了探讨,提出解决的建议,为"大学生创新性实验计划"的有效实施和长效管理建立参考。

新疆石河子地区棉花黄萎病菌分离鉴定及其致病力分析

旨在探究新疆石河子地区棉花黄萎病菌遗传变异及致病力分化情况。通过对分离菌株显微观察、ITS序列克隆及分子进化树的构建,对来源不同的棉花黄萎病菌分离鉴定以及致病力进行分析研究。结果表明:分离得到的24株棉花黄萎菌均属大丽轮枝菌(Verticillium dahliae),其中11株菌株为落叶型棉花黄萎菌,其余为非落叶型棉花黄萎菌;分子进化树结果显示24株菌在系统进化方式上属于2个不同的分支;相同寄主的致病力结果显示24株菌的致病力分为强中弱3个类型,其中强致病力比例为75%,相比2010年的51.7%提高了23.3%,表明石河子地区棉花黄萎菌群体致病力类型发生较大变化,强致病力菌系的比例增加,这或许与石河子地区常年种植棉花有一定的关系;其中SHZ-9为致病力最强的菌系,而SHZ-4为致病力最弱菌系,表明石河子地区黄萎菌存在着明显的致病力分化现象;不同致病力菌株按照营养亲和性可分为3个营养亲和群(VCGs)。本研究结果表明新疆石河子地区棉花黄萎病的致病菌基本是大丽轮枝菌,强致病力菌系占的比例在增加,且菌株在遗传分化上存在明显差异。

小拟南芥Na^+/H^+逆向转运蛋白基因的克隆及生物信息学分析

为了克隆新疆特色植物小拟南芥(Arabidopsis pumila)的Na+/H+逆向转运蛋白基因,本研究以经200mmol/L NaCl胁迫诱导12h的叶片总cDNA为模板,采用RT-PCR技术克隆到Na+/H+逆向转运蛋白基因,命名为ApNHX1(GenBank登录号:JF357965)。结果表明:ApNHX1全长开放阅读框1617bp,编码538个氨基酸残基。利用相关的生物信息学软件对ApNHX1蛋白氨基酸的等电点、结构域、二级结构组成、跨膜结构、亲水性等进行研究,并且构建植物NHX1基因家族系统进化树,结构表明ApNHX1和拟南芥、鼠尔芥、盐芥和油菜等的NHX1同源基因遗传距离最为接近,属于Ⅰ型液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白。因此,构建植物过量表达载体p35S::ApNHX1,转化到农杆菌GV3101中,这为进一步研究基因功能奠定基础。

不同色彩矮牵牛DFR基因的克隆与生物信息学分析

二氢黄酮醇4-还原酶基因(DFR)是花色素合成途径中的一个关键基因。以新疆种植的白、红和蓝色矮牵牛为试验材料,通过同源克隆的方法从花中克隆到3个完整的DFR基因的全长编码序列(CDS),与已知的矮牵牛DFR基因(GenBank登录号:X15537)序列的相似性分别为97.79%、96.59%和97.99%,分别命名为PhDFR1,PhDFR2和PhDFR3;3个基因编码380个氨基酸,同已知矮牵牛DFR基因编码的蛋白(GenBank登录号:CAA33544)的同源性分别是95.53%、94.21%和95.79%;生物信息学分析表明,3个蛋白均具有NADB-Rossmann家族中高度保守的NADPH结合位点、底物特异性结合位点。3个矮牵牛品种DFR都不具有信号肽,为亲水蛋白,定位于细胞质的可能性最高;均具有两个跨膜结构,α-螺旋和β-折叠是3个DFR的主要二级结构元件,并且形成了β-α-β-α-β的Rossmann折叠,整本上呈对称分布。利用同源建模分析3个DFR蛋白与已知葡萄的DFR晶体结构有很高的相似性。系统进化树分析表明,PhDFR1、PhDFR2、PhDFR3与已知矮牵牛DFR蛋白亲缘关系最近。

小拟南芥HDG12基因的克隆、生物信息学分析及植物表达载体的构建

以小拟南芥基因组DNA为模板，运用同源克隆法获得小拟南芥HDG12基因，命名为ApHDG12。运用生物信息学方法，对ApHDG12基因的理化性质、保守序列、二级结构、亚细胞定位等进行了分析，并进行同源建模。经测序和生物信息学软件预测分析，结果显示，ApHDG12基因由10个外显子和9个内含子组成，mRNA长度为2064 bp，编码687个氨基酸，亚细胞定位于细胞核。系统进化树显示ApHDG12与Capsella rubella遗传距离最近，CDD保守序列分析结果显示ApHDG12有18～79位的同源异型域和206～436位的START结构域，属于HD－zipⅣ类基因家族，同时构建了植物表达载体pBI121：HDG12，转化到农杆菌GV3101中，为进一步研究基因功能奠定基础。

利用Gateway技术构建天山雪莲cDNA表达文库

以天山雪莲为材料,利用gateway技术构建天山雪莲cDNA表达文库。从经低温处理后的天山雪莲叶片中提取并分离mRNA,合成双链cDNA;cDNA经BP重组反应重组到入门载体pDONR222上,构建得到天山雪莲en-try cDNA文库;天山雪莲entry cDNA再经LR重组反应将雪莲cDNA重组到植物表达载体pLEELA上,从而构建了天山雪莲cDNA表达文库。结果表明:cDNA入门文库滴度达到1.2×107cfu/mL,文库总容量为4.8×107cfu。表达文库的滴度为6.9×106cfu/mL,文库总容量为2.76×107cfu,插入片段平均大小1000 bp。阳性克隆率100%。天山雪莲cDNA表达文库的建立为进一步高通量筛选天山雪莲抗寒基因奠定了基础。

天山雪莲水孔蛋白基因(AQP)家族鉴定与生物信息学分析

为研究新疆天山雪莲水孔蛋白基因(AQP)家族并对其基因家族成员进行鉴定及分类,从雪莲转录组数据库中获得了33条天山雪莲水孔蛋白基因序列,利用生物信息学软件,将其与拟南芥中38条水孔蛋白基因序列进行分析、分类和保守序列分析,结果显示天山雪莲33条AQP基因家族序列与拟南芥38条AQP基因序列一样分成4个亚族,即质膜水孔蛋白(Plasma membrane intrinsic protein,PIP)基因、液泡膜内在水孔蛋白(Tonoplast intrinsic protein,TIP)基因、类Nodulin(NOD26)膜内在水孔蛋白(NOD26-like membrane intrinsic protein,NIP)基因和膜内小基本蛋白(Small and basic membrane intrinsic protein,SIP)基因。拟南芥与天山雪莲AQP基因间具有较高的保守性。对天山雪莲AQP基因家族进行了系统进化树构建,并分析了水孔蛋白氨基酸组成成分、理化性质,预测了二级结构,发现水孔蛋白不同亚族间氨基酸数目、氨基酸序列间的亲水性存在一定差异,水孔蛋白的二级结构以α螺旋、β折叠、无规则卷曲为主。从这33条AQP基因序列中克隆了3个水孔蛋白基因,测序结果证明天山雪莲转录组数据库基因序列准确率较高。

两种不同生境植物棉花与雪莲CDPK1基因的克隆及生物信息学分析

为了研究两种不同生境植物钙依赖性蛋白激酶基因1(CDPK1)的差异,分别从冷敏感作物陆地棉和高耐寒植物天山雪莲中克隆得到GhCDPK1和SikCDPK1基因。通过生物信息学分析发现,GhCDPK1和SikCDPK1的开放阅读框长度分别为1 764 bp和1 716 bp,各编码587和571个氨基酸。蛋白质表现为弱酸性,且不稳定,亲水;二级结构中以无规则卷曲和α-螺旋为主,三级结构同源建模成功;无跨膜结构域和信号肽,有多个磷酸化位点,但数量存在差异;均具有典型的CDPK保守结构域。GhCDPK1和SikCDPK1氨基酸序列同源性为79.9%,二者明显的区别在于GhCDPK1含有4个EF-hand基序,但SikCDPK1只存在2个EF-hand基序。进化分析结果表明,GhCDPK1与可可CDPK1亲缘关系最近,SikCDPK1与菊花CDPK2亲缘关系最近。

棉花GhFTL1基因的克隆及初步功能分析

通过RT-PCR结合RACE技术,从新疆陆地棉品种新陆早33中克隆到一个FT类似基因,命名为GhFTL1基因(登录号:HM631972)。该基因ORF(Open Reading Frame)全长为525 bp,可编码174个氨基酸,与其它植物中克隆的FT同源蛋白高度相似,含有FT蛋白亚家族两个关键的氨基酸残基及保守氨基酸基序。该基因在根、茎、花、叶片、纤维和胚珠中均有表达,且在叶片和胚珠中的表达要稍高于其它组织。系统进化分析表明GhFTL1属于FT亚家族成员。在18个已经证明可以促进植物开花的FT同源基因中,GhFTL1同苹果的MdFT1的遗传距离最接近。在拟南芥中过量表达GhFTL1,T1转基因植株要比野生型明显提早开花。表明GhFTL1可能属于开花途径中的重要作用因子之一。

转拟南芥ICE1基因增强烟草抗寒性的研究

ICE1是CBF冷响应通道的上游转录调控因子,通过与CBF启动子中MYC顺式作用元件的结合激活CBF3基因表达。采用RT-PCR方法,从拟南芥获得AtICE1基因,将AtICE1导入pCAMBIA1301构建35S∷AtICE1植物表达载体。通过根癌农杆菌GV3101,将AtICE1基因导入烟草,T1代植株经潮霉素抗性筛选,PCR、RT-PCR检测,结果表明AtICE1基因已经整合到烟草基因组中,并在转录水平表达;在正常生长条件下,转基因烟草与对照烟草的生长未见明显区别,而在瞬时低温冻害下,转基因烟草存活率明显高于对照烟草植株,说明AtI-CE1基因可以提高低温敏感作物的耐寒性。

GFP基因在新疆小拟南芥和拟南芥中的表达分析

以质粒pMCB30为模板,扩增GFP基因,连接到载体pCMBIA2300-35S-OCS上,构建过量表达载体p35S:GFP,将其转入农杆菌GV3101.通过农杆菌介导法将p35S:GFP载体分别转入新疆特色植物小拟南芥和拟南芥中.T0代经含有卡那霉素的1/2MS培养基筛选,获得了T1代转基因小拟南芥2株,T1代转基因拟南芥9株.通过激光共聚焦显微镜观察,在转基因小拟南芥和拟南芥的根尖细胞中均可检测到GFP绿色荧光蛋白;对转基因植株进行PCR扩增,均可检测到GFP基因,表明GFP基因已成功转入小拟南芥和拟南芥中.该研究建立了小拟南芥的遗传转化体系,为进一步利用GFP基因和进一步研究小拟南芥的功能基因奠定基础.

转天山雪莲sikPIP_3基因烟草的获得及抗逆性鉴定

利用PCR技术从实验室建立的天山雪莲DNA文库中克隆了天山雪莲质膜水孔蛋白基因sikPIP3,构建了植物表达载体pBI121-sikPIP3,通过农杆菌介导法转化烟草品种NC89,经PCR和RT-PCR检测证明目的基因成功导入并得到了表达,采用水分胁迫进行抗旱分析和采用冷冻胁迫进行抗寒性分析。结果显示:(1)克隆出具有水孔蛋白基因特性的sikPIP3基因。(2)经断水干旱处理,转基因烟草的生长表型优于野生型烟草,特别是在断水9d的情况下,野生型烟草已经完全萎蔫,转基因烟草萎蔫症状较轻;生理指标测量结果显示,转基因烟草的相对电导率和MDA的含量低于野生型烟草,相对含水量和CAT活性高于野生型烟草。试验表明转sikPIP3烟草的抗旱性高于野生型烟草。(3)经不同温度胁迫处理,转基因烟草的生长表型优于野生型烟草,特别是在-4℃冷处理6h情况下,野生型烟草已经完全萎蔫,转基因烟草只出现少量伤斑;生理指标分析结果表明,转基因烟草的相对电导率和MDA的含量低于野生型烟草,CAT活性高于野生型烟草。试验表明转sikPIP3烟草的抗寒性高于野生型烟草。综合结果表明:sikPIP3基因在抗逆基因工程方面具有较高的应用前景。

不同浓度烯效唑与胺鲜脂复配剂浸种对玉米幼苗抗旱性的影响

用不同质量浓度烯效唑、胺鲜脂配比的复配剂对玉米种子‘郑单958’进行12h及24h的浸种处理,测定玉米的发芽情况、幼苗形态指标以及干旱胁迫下玉米幼苗叶片的相对含水量、相对电导率、丙二醛浓度、过氧化氢酶活性、叶绿素质量分数。结果表明,当40mg/L烯效唑、50g/L胺鲜脂配比下浸种24h时,显著抑制玉米种子的芽长,但对玉米种子的发芽率影响不大,促进幼苗壮苗的形成;对干旱的抗性响应因浸种时间不同而异,在浸种12h时,不同质量浓度烯效唑、胺鲜脂配比的混合剂中烯效唑质量浓度高效果优于质量浓度低的处理,而在浸种24h时,烯效唑质量浓度低效果反而优于质量浓度高的处理。通过形态及生理指标的测定,已明确40mg/L烯效唑、50g/L胺鲜脂的配比质量浓度进行浸种处理24h对玉米有较好的壮苗效果及提高植物抗逆性的作用。

海岛棉GbMFT1基因的克隆及表达分析

通过RT-PCR和RACE技术,从新疆海岛棉品种新海14中克隆得到了一个MFT(MOTHER OF FT AND TFL1)类似基因,命名为GbMFT1基因(GenBank登录号为KC513744)。GbMFT1基因的开放阅读框(ORF)为528 bp,编码175个氨基酸的蛋白,含一个磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)结构域。GbMFT1蛋白的羧基端含有MFT蛋白都含有的脯氨酸。系统进化树分析表明GbMFT1编码产物与葡萄、番茄亲缘关系较近,属于同一进化分支。实时荧光定量PCR分析表明,GbMFT1基因在棉花的不同组织中均有表达,在花瓣中的表达量较高;在纤维发育的不同时期中均有表达,在开花后2 d的胚珠、9 d的纤维中表达量最高。半定量RT-PCR结果表明,GbMFT1基因在刚萌发的种子中表达量高,用不同浓度的ABA处理种子后其表达变化不明显,表明GbMFT1基因的表达不受ABA的调节。

新陆早42号体细胞胚发生和植株再生

以新陆早33号为对照研究新疆主栽品种新陆早42号的体细胞胚胎发生。研究表明,所用4种激素组合均能有效诱导愈伤组织,但二者仅在经过IBA 1.0 mg.L-1+KT 0.5 mg.L-1和2,4-D 0.1 mg.L-1+KT 0.1 mg.L-1两种激素组合诱导初生愈伤后,才能胚胎发生。新陆早42号在IBA 1.0 mg.L-1+KT 0.5 mg.L-1培养基上46 d就开始胚胎发生;新陆早33号则不能直接胚胎发生,需继代到MSBP培养基上培养48 d才有胚胎发生。经2,4-D 0.1 mg.L-1+KT 0.1 mg.L-1组合培养的愈伤均需要继代到MSBP培养基上培养才能胚胎发生,新陆早42号和新陆早33号胚胎发生的最早时间分别是71 d和81 d。胚性愈伤在铺有滤纸的MSBF培养基上分化成胚并发育成再生植株。新陆早42号在140 d有根系发育良好的能嫁接植株(株高7～8 cm),而新陆早33需180 d。即成功建立了新陆早42号的再生体系,且其胚胎发生能力和再生能力均优于对照。

HARDY基因植物表达载体的构建及在番茄中的遗传转化

HARDY(HRD)是AP2/ERF-like家族转录因子的一员,已有的研究表明它的过量表达可以增强水稻的抗旱性、提高水稻的水分利用效率。为了研究它是否在其他的农作物中具有普遍的适用性,本试验从拟南芥中克隆了HRD基因,成功构建了HRD基因的高效植物表达载体pBIN-HRD。采用农杆菌介导法转化番茄(亚心87-5),经PCR、RT-PCR分析表明,阳性的转HRD基因植株已获得表达。

新疆无苞芥Na＋/H＋逆向转运蛋白基因OpNHX1的克隆、表达分析与功能验证

从耐盐植物无苞芥中克隆获得了1个Na+/H+逆向转运蛋白基因NHX1,命名为OpNHX1(GenBank登录号:KC200248)。OpNHX1基因cDNA全长2 153 bp,包含一个1 605 bp的开放阅读框,编码534个氨基酸。系统进化树分析表明,OpNHX1编码产物与拟南芥、小盐芥亲缘关系较近,属于同一进化分支。实时荧光定量PCR分析表明,该蛋白基因在无苞芥根、茎、叶、花和荚果中均有表达,其中茎中表达量最高。半定量RT-PCR分析表明,该基因受高盐、干旱、低温及ABA的诱导上调表达。进一步将该基因在拟南芥中过量表达,显著提高了转基因植株在盐胁迫下的存活率,说明OpNHX1基因参与了植物的耐盐性。酵母功能互补试验结果显示,该基因转化酵母Δnhx1后可以补充NHX1的缺失,表明OpNHX1参与Na+/H+的转运。

小拟南芥液泡膜H^+-PPase基因OpVP1的克隆、序列分析及表达

植物液泡膜质子转运无机焦磷酸酶(V-PPase)酸化植物液泡并为液泡的次级转运系统提供能量,在植物耐盐性起着重要的作用。为了克隆小拟南芥液泡膜H+-PPase基因,采用RT-PCR结合RACE的方法从小拟南芥叶片的cDNA中克隆了1个液泡膜H+-PPase基因,命名为OpVP1。OpVP1基因的cDNA全长为2698bp,开放阅读框(ORF)为2313bp,编码770个氨基酸。OpVP1蛋白与琴叶拟南芥、拟南芥相似性最高,分别为98.6%、98.4%。系统进化分析表明OpVP1基因属于Ⅰ型液泡膜质子焦磷酸酶基因。OpVP1蛋白的分子量是80745.9Da,等电点pI为5.13,含有14个跨膜螺旋结构。三维结构分析表明OpVP1蛋白是由2个单体组成的二聚体蛋白。qRT-PCR表明OpVP1基因在角果中表达高于根、茎、叶和花中的表达。