春尺蠖几丁质酶AcinCht10基因的克隆及在逆境胁迫下的表达

【目的】探究春尺蠖(Apocheima cinerarius)响应逆境胁迫的分子机理,并挖掘与低温和饥饿胁迫相关的主要关联基因,为进一步揭示春尺蠖响应逆境胁迫的分子机理奠定基础。【方法】基于已测春尺蠖3龄幼虫在不同温度及4龄幼虫在不同时间饥饿胁迫的转录组数据,克隆获取几丁质酶基因,命名为AcinCht10(基因登录号:OK504624),分析该基因的分子特征及其氨基酸的基本理化性质,进行序列比对并构建系统进化树,并分析该基因在逆境胁迫(低温和饥饿)下的表达谱。【结果】春尺蠖AcinCht10基因预测分子式为C_(5017)H_(7689)N_(1349)O_(1490)S_(39),编码蛋白区全长2967 bp,共编码988个氨基酸,蛋白的预测分子量111.99 kDa,理论预测等电点为6.25,该蛋白的亲水性系数为-0.547,预测不稳定系数值为37.19,为稳定亲水性蛋白;发现1条信号肽,未发现跨膜结构;发现2个催化区和1个几丁质结合域;磷酸位点检测发现丝氨酸48个,苏氨酸43个,酪氨酸14个,未检测到糖基化位点。序列比对结果显示,春尺蠖AcinCht10与其它鳞翅目昆虫的几丁质酶基因氨基酸一致性较高,均在91%以上;系统进化结果显示,搜索获取昆虫的几丁质酶基因分别聚为8类(I~VIII型),同时春尺蠖AcinCht10与同为鳞翅目昆虫的烟草天蛾(Manduca sexta)MsexCht10、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)TniCht10和亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)OfurCht10聚为一类。基因表达分析结果显示,AcinCht10基因随着饥饿处理时间的增加,表达量依次降低且相邻处理间的表达量差异不显著。AcinCht10基因在25℃处理下表达量最高,而在其余温度胁迫下表达量均处于较低水平且差异不显著。【结论】AcinCht10基因与春尺蠖应对低温及饥饿胁迫的响应密切相关。该结果有助于揭示春尺蠖几丁质酶基因在逆境胁迫下的分子功能,为进一步揭示春尺蠖响应逆境胁迫的分子机理奠定基础。

春尺蠖可溶性海藻糖酶AcinTre1A和AcinTre1A-like基因的克隆及饥饿胁迫下表达谱

海藻糖酶(trehalase,Tre)是昆虫体内海藻糖代谢的关键酶,在生长发育与能量调节中扮演重要角色。为克隆春尺蠖(Apocheima cinerarius)海藻糖酶基因,分析其序列特征及系统进化关系,同时对其在不同饥饿处理时间下的表达水平进行分析,明确海藻糖酶基因在春尺蠖应对饥饿胁迫中的作用,基于春尺蠖4龄幼虫转录组数据,结合RT-PCR技术克隆春尺蠖Tre和Tre-like基因,分析其氨基酸的理化性质,同时分析序列一致性及系统进化关系。克隆获取春尺蠖2条可溶性Tre和Tre-like基因,分别命名为AcinTre1A和AcinTre1A-like,预测分子式分别为C_(3122)H_(4716)N_(806)O_(934)S_(16)和C_(3037)H_(4620)N_(800)O_(856)S_(14),CDS全长分别为1803、1746 bp,分别编码601、582个氨基酸,蛋白的预测分子量分别为68.99、66.48 ku,理论预测等电点分别为4.95、6.08;AcinTre1A为不稳定亲水蛋白,而AcinTre1-like为稳定亲水蛋白;编码蛋白均具有海藻糖酶超家族保守结构域、信号肽,但无跨膜结构;磷酸位点检测在AcinTre1A与AcinTre1A-like中分别发现丝氨酸26、22个,苏氨酸16、11个,酪氨酸13、15个;均发现1个糖基化位点。序列一致性分析表明,春尺蠖AcinTre1A与灰斑霜尺蠖Apocheima pilosaria的一致性最高,为88.54%,AcinTre1A-like与烟草天蛾Manduca sexta的一致性为79.21%;系统进化结果表明,AcinTre1A和AcinTre1A-like分别聚在2个分支上;春尺蠖AcinTre1A与同为尺蛾科的灰斑霜尺蠖ApilTre1A聚为一类,AcinTre1A-like与天蛾科的烟草天蛾聚为一类;斜纹夜蛾Spodoptera litura与草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda Tre-like基因在系统进化树中与其他昆虫的Tre更近。基因表达结果表明,随着饥饿处理时间的增加,AcinTre1A和AcinTre1A-like的表达量均呈现下降趋势,AcinTre1A-like下降速度较缓,AcinTre1A则下降较快;与对照相比,除6 h外,其余时间基因表达量均差异显著(P<0.05)。海藻糖酶基因在春尺蠖应对饥饿胁迫的响应中扮演重要角色。