miRNA-21与肿瘤相关研究新进展

小RNA(microRNA,miRNA)是近年发现的一类内源性非编码单链RNA,在转录后水平对基因表达发挥负调控作用,参与细胞生长、发育、凋亡等重要生物过程。研究发现miRNA-21在肿瘤的发生发展过程中扮演着非常重要的角色,在不同类型肿瘤中的表达均出现明显上升,与肿瘤细胞的增殖、侵袭、血管的生成和抗药性等生物学行为相关。本文将从miRNA-21的表达与定位、对靶基因的调控以及对miRNA-21的转录调控等方面进行综述。

靶向表皮生长因子受体的小分子RNA干扰抑制人脑胶质瘤Notch1表达的实验研究

目的探讨RNA干扰表皮生长因子受体后Notch1在人脑胶质瘤中的表达变化。方法应用免疫组织化学方法检测不同级别脑胶质瘤组织标本中Notch1的表达水平,并进行相关分析。选择人表皮生长因子受体的两个RNA干扰靶序列构建靶向表皮生长因子受体的RNA干扰表达质粒,进行脂质体介导的TJ905人脑恶性胶质瘤细胞系表达;应用荧光定量逆转录-聚合酶链反应仪观察RNA干扰表皮生长因子受体后TJ905人脑恶性胶质瘤细胞系Notch1的表达变化。结果免疫组织化学检测显示,在不同级别胶质瘤组织标本中Notch1的阳性表达率分别为Ⅳ级93.33%(14/15);Ⅲ级92.31%(12/13);Ⅱ级68.42%(13/19)。Ⅱ级阳性表达程度较Ⅲ、Ⅳ级弱,组间差异有高度统计学意义(H=6.944,P<0.01),提示高级别胶质瘤Notch1阳性表达率高于低级别。RNA干扰表皮生长因子受体后,Notch1在TJ905胶质母细胞瘤细胞系中的表达下降(F=578.728,P<0.01):TJ905组与TJ905+空载组相比,差异无统计学意义(P>0.05);TJ905+空载组与TJ905+516组相比,差异有统计学意义(q=6.359,P<0.05);TJ905+516组与TJ905+2400组比较,差异有统计学意义(q=4.501,P<0.05);TJ905组与TJ905+2400组相比差异亦有统计学意义(q=10.015,P<0.05)。责任基因相对表达量,TJ905组和TJ905+空载组均为2.48×10-5,TJ905+516组为6.64×10-6,TJ905+2400组为2.08×10-7。结论表皮生长因子受体与Notch1关系密切,对二者关系的进一步研究可为胶质瘤的基因治疗提供新的思路。

反义及显性负调节AKT2抑制胶质瘤侵袭和迁移的实验研究

近来的研究显示AKT激酶家族成员在调节细胞生长、增殖、存活和代谢等方面的信号传导系统中起着极为重要的作用。本文以AKT2为对象,研究反义AKT2 cDNA(antisense AKT2,AS-AKT2)和显性负调节AKT2(dominant negative AKT2,DN-AKT2)cDNA构建体调控恶性胶质瘤侵袭性生长的作用及其机制。方法:利用反义AKT2 cDNA和显性负调节AKT2cDNA构建体转染鼠脑胶质瘤细胞系C6,分别在RNA水平和蛋白水平阻断AKT2通路,将野生型和转染pLXSN空载体的C6细胞作为对照。原位杂交和蛋白印迹鉴定后,Transwell和球体培养法分析侵袭能力,球体培养和划痕实验研究细胞迁移能力,明胶酶谱分析转染前后MMP2/9酶活性变化。结果:原位杂交和蛋白印迹结果表明,C6胶质瘤细胞系在mRNA和蛋白水平均高表达AKT2;转染AS-AKT2后AKT2表达被显著抑制,但转染DN-AKT2后AKT2表达无明显变化。C6细胞转染AKT2构建体后应用体外侵袭和迁移的实验量化分析这种效应后发现:利用Matrigel夹心法和Transwell方法研究发现,C6细胞转染AKT2构建体后侵袭能力下降46%～57%,细胞迁移能力下降23%～42%。明胶酶谱分析发现MMP2/9和pro-MMP9的活性被明显抑制。结论:AKT2可以通过调节MMP2/9活性调控恶性胶质瘤侵袭性生长,因此AKT2可能成为抑制胶质瘤侵袭性生长的新靶标。

miR-200a通过β-catenin/TCF-4信号通路抑制胃癌细胞系生长侵袭能力的体外研究

目的:研究miR-200a通过β-catenin/TCF-4信号通路对SGC7901胃癌细胞增殖活性及侵袭迁移能力的影响。方法:化学合成miR-200a mimics,采用脂质体Lipofectamine 2000转染胃腺癌细胞SGC7901,qRT-PCR检测转染效果,细胞免疫荧光、Western blot检测转染后目的蛋白的表达,TOP/FOP荧光素酶检测β-catenin/TCF-4活性,Transwell、划痕实验检测细胞迁移侵袭能力、MTT法检测细胞的增殖活性,流式细胞术检测细胞周期分布的改变。结果:脂质体介导的miR-200amimics转染SGC7901后,β-catenin/TCF-4蛋白的表达均降低,β-catenin的表达出现了细胞核向胞浆的转移。TOP荧光素酶活性下降2.27倍,而FOP荧光素酶活性基本不变。转染miR-200amimics组细胞的增殖活性、迁移、侵袭能力比空白组和阴性对照组明显下降,细胞周期出现G_0/G_1期阻滞。结论:提高miR-200a表达可以降低β-catenin/TCF-4信号通路的活性,抑制SGC7901的生长侵袭迁移能力。

反义及显性负调节AKT2 RNA对脑胶质瘤细胞增殖抑制作用的体外研究

背景与目的:表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)下游的丝苏氨酸激酶2(serine/threoninekinase2,AKT2)信号转导通路对肿瘤细胞的生存和凋亡具有十分重要的作用。本文研究了反义AKT2(antisenseAKT2,AS-AKT2)和显性负调节AKT2(dominant-negativeAKT2,DN-AKT2)构建体对人脑胶质瘤细胞系TJ905的增殖和凋亡的调控作用。方法:脂质体介导AKT2构建体转染人脑胶质瘤细胞系TJ905,原位杂交和蛋白印迹法检查AKT2的表达水平,Ki-67标记指数和MTT法检测细胞增殖能力,TUNEL法计算凋亡指数评价肿瘤细胞凋亡的变化。结果:对每种AKT2构建体转染后随机选择3个扩增后进一步分析。原位杂交和蛋白印迹结果表明,转染AS-AKT2后AKT2表达显著抑制,转染DN-AKT2后AKT2表达无明显变化。MTT研究发现:AS-AKT2组和DN-AKT2组的6天细胞生存率分别为(49.30～51.46)%和(50.52～55.23)%,细胞存活率显著低于对照组和空载体组(P<0.001);AS-AKT2组和DN-AKT2组的标记指数(Ki-67labelingindex,Ki-67LI)分别为(57.50～59.33)%和(59.17～61.00)%,明显低于对照组(76.50%)和空载体组(74.83%)(P<0.001);TUNEL法凋亡分析表明:对照组和空载体组几乎没有凋亡细胞,AS-AKT2组(8.33%～8.83%)和DN-AKT2组(7.50%～7.83%)

靶向MMP-9的siRNA抑制人类SGC7901胃腺癌细胞侵袭和迁移的研究

目的:探讨基质金属蛋白酶(MMP-9)siRNA对胃腺癌细胞系SGC7901中MMP-9表达的影响以及siRNA干扰后对SGC7901细胞侵袭和迁移的抑制作用。方法:设计合成针对MMP-9的siRNA,采用oligofectamine转染SGC7901胃腺癌细胞,分别采用实时定量聚合酶链反应(realtime PCR)和蛋白印迹法分别检测转染细胞后MMP-9mRNA及蛋白的表达。Matrgel 3D生长实验和Transwell实验检测细胞侵袭情况,Matrgel2D生长实验和划痕实验检测细胞迁移情况。结果:realtime PCR和蛋白印迹法显示转染MMP-9 siRNA后细胞中MMP-9mRNA和蛋白的表达较空白组和对照组明显降低。RNA干扰MMP-9基因后SGC7901细胞的侵袭和迁移能力也有明显下降。结论:靶向MMP-9的siRNA不仅能特异性的降低MMP-9mRNA及蛋白的表达,且能抑制人SGC7901胃腺癌细胞的侵袭和迁移。

反义miR-221/222上调Cx43恢复人胶质瘤细胞系U251细胞间缝隙连接通讯的体外研究

目的探讨反义miR-221/222上调缝隙连接蛋白43(Cx43)以恢复人胶质瘤细胞系U251细胞间缝隙连接通讯的作用机制。方法脂质体共转染反义寡核苷酸(AS-miR-221/222),下调U251细胞miR-221和miR-222表达水平,采用Northern blotting法检测U251细胞miR-221和miR-222表达水平;虫荧光素酶活性分析并获得靶基因;Western blotting法和免疫荧光法检测U251细胞Cx43表达水平;划痕标记染料示踪技术检测细胞间缝隙连接通讯。结果 AS-miR-221/222组U251细胞miR-221(t=1312.152,P=0.000)和miR-222(t=1226.031,P=0.000)表达水平明显降低;荧光活性明显高于其他各组(均P=0.000),证实Cx43基因为miR-221和miR-222靶基因;Cx43表达水平亦明显升高,且高于无义序列组(t=735.768,P=0.000)和对照组(t=686.252,P=0.000)。对照组和无义序列组U251细胞细胞间缝隙连接通讯缺失,罗氏黄仅传递划痕细胞边缘单列细胞;AS-miR-221/222组U251细胞细胞间缝隙连接通讯明显恢复,罗氏黄传递至划痕细胞邻近7～8列细胞。结论反义miR-221/222可通过上调Cx43表达水平恢复人胶质瘤细胞系U251细胞间缝隙连接通讯。

脑胶质瘤信号转导通路研究进展

脑胶质瘤是临床最为常见的原发性颅内肿瘤，约占颅内肿瘤的46％，占成年人全身肿瘤的2％；恶性胶质瘤的发病率为（5—8）／100万，在1998年WH0公布的按死亡率顺序排位中，恶性胶质瘤为34岁以内患者的第2位死亡原因，35～54岁患者的第3位死亡原因。脑胶质瘤难以通过手术完全切除，而药物化疗和放射治疗不能高度特异性地杀伤肿瘤细胞，并且可能产生严重的不良反应。近30年的临床实践显示，上述情况并未得到根本的改善，

靶向AKT1和COX-2的RNAi抑制U251胶质瘤细胞侵袭的体外实验

目的应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术敲低恶性胶质瘤细胞系U251中AKT1和COX-2表达后,在体外对细胞侵袭转移的抑制作用,初步探讨其可能的作用机制。方法构建重组腺病毒载体rAd5-A-C同时搭载靶向AKT1和COX-2的shRNA干扰序列,将其转染至恶性胶质瘤细胞系U251细胞。Realtime PCR检测RNAi后目的基因mRNA的表达水平,Western Blot检测目的基因及MMP-2、MMP-9、TIMP-2的表达情况。酶联免疫吸附试验检测转染前后分泌到细胞外的MMP-2和MMP-9的浓度变化。划痕实验和Transwell实验评价肿瘤细胞转染前后的细胞侵袭能力的变化。结果rAd5-A-C转染组AKT1和COX-2的mRNA和蛋白表达均明显抑制;MMP-2、MMP-9表达下调,TIMP-2表达则上调。ELISA检测胞外MMP-2、MMP-9浓度明显减低;划痕实验显示细胞转移运动能力明显减弱,Transwell体外侵袭实验结果显示穿过细胞数明显减低(P<0.001)。结论重组腺病毒介导的RNAi技术可以序列特异性地抑制U251细胞AKT1和COX-2的表达,在体外对U251细胞侵袭转移产生明显抑制作用,可能成为恶性胶质瘤治疗的新策略。

应用流式细胞术对胶质瘤DNA含量的研究

应用流式细胞术对胶质瘤ＤＮＡ含量的研究李峰，浦佩玉，王广秀目前，利用ＦＣＭ（Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）对脑瘤进行细胞群体的ＤＮＡ倍体水平及增殖活性研究的国外文献报告结果不尽一致，对胶质瘤的ＦＣＭ测定国内仅有少数报道［１￣３］。故本文对不同病理类型的...

miRNA在恶性肿瘤诊断与治疗中的进展

微小RNA(microRNA或miRNA)是指长度约21～25nt的某些特殊的小型非编码RNA组成的家族,miRNA在转录后水平通过促进靶mRNA的降解和/或抑制翻译过程而发挥负调控基因表达的过程,并与个体发育、干细胞分化和疾病发生密切相关,在包括胶质瘤在内的所有恶性肿瘤的发病机制、早期诊断以及寻找新的治疗策略的研究中意义重大。

胶质瘤细胞U251中RNA干扰敲低wnt2的表达下调PI3K/AKT信号通路的体内外研究

目的:研究人脑胶质瘤细胞U251中RNA干扰敲低wnt2的表达对PI3K/AKT信号通路的影响。方法:向U251细胞转染靶向Wnt2的siRNA后,免疫印记及免疫荧光检测转染后,Wnt2、Frizzled2、β-catenin、PI3K、磷酸化AKT的表达变化。建立裸鼠胶质瘤皮下动物模型,瘤内注射Wnt2siRNA观察以上指标的表达变化。结果:体外应用RNA干扰敲低Wnt2的表达后,frizzled2、β-catenin、PI3K、p-AKT的表达均下调。结论:胶质瘤细胞U251中RNA干扰敲低Wnt2的表达后,PI3K/AKT信号通路活性受到抑制。

Notch信号通路异常和肿瘤的生成

近年研究表明,Notch信号通路与肿瘤发生有关,但Notch对肿瘤的发生、发展可以起着截然相反的作用。在某些组织中Notch单个或多个成员具有显性癌基因作用,而在另一些组织量则发挥着抑癌基因的功能。本文就Notch在肿瘤研究中的研究进展作以综述。

miR-137调控人脑胶质瘤细胞增殖侵袭能力的体内外研究

目的探讨miR-137调控人脑胶质瘤细胞的增殖侵袭性生长能力及其机制。方法采用实时PCR分析miR-137在不同品系胶质瘤细胞及不同级别胶质瘤样本中的表达;脂质体介导miR-137模拟物转染胶质瘤细胞,实时PCR检测转染后miR-137的表达;应用MTT法、流式细胞术评价细胞生长和增殖的生物学特征变化;划痕实验、transwell细胞体外迁移实验检测肿瘤细胞迁移、侵袭能力;动物实验评价体内条件下肿瘤生长能力变化;Western blot、免疫组织化学染色检测肿瘤细胞Ki-67、MMP9表达水平。结果实时PCR分析显示:miR-137在胶质瘤中低表达。miR-137模拟物转染LN229和U87细胞后,实时PCR显示:miR-137表达上调;MTT法及流式细胞术显示细胞生长受抑,出现G0/G1期阻滞;划痕实验及transwell实验证实:细胞迁移侵袭能力下降;进一步Western blot、免疫组织化学染色显示:增殖侵袭相关蛋白Ki-67、MMP9表达降低;动物实验反映:肿瘤细胞生长受抑制。结论 miR-137高表达可抑制胶质瘤细胞生长和侵袭能力,提示miR-137可作为基因治疗脑胶质瘤的候选靶点。

miRNA海绵在胃癌细胞EMT过程中调控作用的体外研究

目的:探讨"miRNA海绵"在胃癌细胞系SGC7901上皮-间质转化(EMT)过程中的作用及机制。方法:将人工合成的ZEB2 3'UTR质粒及siZEB2采用脂质体Lipofectamine 2000转染SGC7901细胞。qRT-PCR检测转染后miR-200a/b/c的表达;Tran-swell侵袭实验、划痕实验和克隆形成实验检测细胞侵袭迁移增殖能力;Western Blot检测目的蛋白的表达。结果:与对照组相比,ZEB2 3'UTR转染组miR-200a/b/c的表达均下调,迁移、侵袭、增殖活性均增强;而转染siZEB2后miR-200a/b/c表达均升高,迁移、侵袭、增殖能力则下降。Western Blot显示ZEB2 3'UTR转染导致ZEB2表达升高,E-cadherin表达下降,而Vimentin表达上调;而转染siZEB2后,各项指标则表现出相反的表达趋势。结论:ZEB2 3'UTR可以通过调控miR-200a/b/c的表达调控胃癌细胞EMT过程,调节肿瘤的侵袭与转移。

蛋白激酶N1对脑胶质瘤生物学行为的影响

目的探讨蛋白激酶N1(PKN1)在胶质瘤组织中的表达变化及其对胶质瘤细胞生物学行为的影响。方法检索GEPIA数据库验证PKN1基因表达情况,Western blotting法检测胶质瘤细胞系LN229、U87和A172的PKN1蛋白表达量。采用无意义序列(siRNA-NC组)和PKN1小干扰RNA序列(siRNA-PKN1组)转染A172细胞,并通过CCK-8实验、流式细胞术、细胞划痕实验和Transwell实验检测肿瘤细胞增殖能力、凋亡率、迁移能力和侵袭能力。结果经检索GEPIA数据库发现胶质母细胞瘤组织(163例)PKN1 mRNA表达量高于正常脑组织(207例,P<0.05)。Western blotting检测显示,A172细胞PKN1蛋白相对表达量高于U87细胞(t=3.096,P=0.036)和LN229细胞(t=8.994,P=0.000)。敲低PKN1基因表达第3~6天siRNA-PKN1组A172细胞增殖能力低于siRNA-NC组(t=3.275,P=0.031;t=5.949,P=0.004;t=10.430,P=0.000;t=6.645,P=0.003);两组A172细胞划痕愈合率随时间推移具有不同程度增加(F=249.993,P=0.000),敲低PKN1基因表达后,A172细胞划痕愈合率(F=97.811,P=0.000)和细胞穿膜数目(t=5.840,P=0.004)均低于siRNA-NC组,而A172细胞凋亡率高于siRNA-NC组(t=5.461,P=0.006)。结论胶质瘤PKN1 mRNA表达量高于正常脑组织,敲低PKN1基因表达可抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭,同时诱导肿瘤细胞凋亡。

胶质瘤中EGFR扩增、过表达及其与肿瘤增殖关系的研究

目的探讨表皮生长因子受体(EGFR)在胶质瘤中扩增、过表达及其在肿瘤增殖中的作用机制。方法应用SP免疫组化法、RT-PCR、Southern印迹法检测6例正常脑组织、50例不同级别胶质瘤及2个体外胶质瘤细胞系中在EGFR蛋白水平、mRNA水平、DNA水平的表达及扩增情况,以及与肿瘤增殖活性的相关性。结果不同级别的胶质瘤中,表达与扩增程度不同,Ⅱ级与Ⅲ、Ⅳ级肿瘤之间比较具有显著性差异;EGFR过表达与Ki-67在胶质瘤中的表达呈正相关,而EGFR过表达与扩增并不一致。结论EGFR过表达与胶质瘤的增殖活性增高有密切相关性,推测EGFR过表达是肿瘤进展中的早期事件而非进展期事件。

白藜芦醇抑制胶质瘤细胞增殖的体内外实验研究

目的探讨白藜芦醇(Res)对C6胶质瘤细胞增殖的抑制作用及其机制。方法将不同浓度Res作用于C6大鼠胶质瘤细胞系,MTT法检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞周期及凋亡,蛋白印迹(Western blot)检测Res处理前后C6细胞表皮生长因子受体(EGFR)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达;免疫组化分析基质金属蛋白酶(MMP)-9、转录核因子-κB(NF-κB)的表达。应用立体定向术建立大鼠动物模型,将20只大鼠分为对照组和治疗组,治疗组8只以8 mg·kg-1·d-1的剂量饲喂,2只以16 mg·kg-1·d-1的剂量饲喂,观察动物一般表现及生存期。MRI动态监测肿瘤大小,脑标本进行病理组织学及相关指标检测。结果在体外Res可明显抑制C6胶质瘤细胞生长,细胞周期被阻滞在S期,诱导肿瘤细胞凋亡,Res可延长荷瘤SD大鼠生存期,免疫组化检测EGFR、MMP-9、NF-κB表达降低,而GFAP表达升高。结论Res可抑制胶质瘤细胞增殖,延长荷瘤动物生存期,具有潜在临床应用价值。

PI3K抑制剂联合Ad-PTEN对裸鼠移植胶质瘤的治疗作用

目的本研究旨在观察磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂LY294002联合含PTEN基因的重组腺病毒(Ad-PTEN)对人脑胶质瘤裸鼠移植瘤的抗肿瘤作用,初步探讨其可能的作用机制。方法将实验动物24只随机分为4组,即胶质瘤模型给予DMSO对照组、空载对照组、LY294002治疗组及LY294002与Ad-PTEN联合治疗组。皮下接种LN229人脑胶质瘤细胞建立胶质瘤裸鼠皮下移植瘤模型,定期测量动物体质量及肿瘤直径;应用免疫组化法检测肿瘤细胞的PTEN、p-Akt、PCNA、CyclinD1、Caspase-3、MMP-2、p-FAK的表达水平。结果联合治疗组对人脑胶质瘤裸鼠移植瘤抑制作用较对照组及LY294002治疗组均明显增强(均P<0.01);与对照组及LY294002治疗组比较联合治疗组Caspase-3、PTEN表达显著升高(均P<0.05),p-Akt、CyclinD1、MMP2、p-FAK的表达均显著下降(均P<0.05)。结论LY294002与Ad-PTEN联合治疗可以提高对裸鼠移植人脑胶质瘤的抑制作用。

U251胶质瘤荷瘤鼠皮下模型的建立及其表皮生长因子受体通路成员异常表达

目的建立稳定可靠的荷瘤鼠皮下U251胶质瘤实验动物模型,使其良好地用于胶质瘤分子机制的研究。方法取生长状态良好的U251胶质瘤细胞悬液按1×106个细胞／50μl接种于10只荷瘤鼠腹腔皮下,待其成瘤后将肿瘤组织块接种于20只实验鼠,观察并记录肿瘤皮下生长情况,于成瘤后第5周处死荷瘤鼠检测是否存在肿瘤远处转移;同时对肿瘤组织行HE和免疫组织化学染色检测胶质瘤的病理学特征,观察表皮生长因子受体、磷酰肌醇3-激酶和丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶-2基因阳性表达率,结果与体外培养的U251胶质瘤细胞系的基因异常表达进行比较。结果细胞悬液接种可成功获得皮下U251胶质瘤模型,但潜伏期延长(2-3周),成功率低(6／10);若将其生成的肿瘤组织块再次接种于荷瘤鼠皮下则可获得高效、稳定的成瘤率(20／20)且潜伏期明显缩短(3d-5d)。荷瘤鼠生长状态良好,无恶病质变化,未发生其他脏器转移。大体标本观察显示,肿瘤体积>750mm3时其内部多见坏死伴囊性变,部分肿瘤尚有脂肪浸润或纤维化;肿瘤有假包膜形成,瘤体部分呈鱼肉状,是胶质瘤生发和再移植取材的部位。免疫组织化学检测显示,荷瘤鼠皮下胶质瘤组织和体外培养的U251胶质瘤细胞对表皮生长因子受体、磷酰肌醇3-激酶以及丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶-2基因通路主要成员的基因表达情况相似。结论将U251胶质瘤细胞悬液接种于荷瘤鼠皮下形成的胶质瘤再移植到荷瘤鼠皮下建立U251移植瘤实验模型的方法简便、潜伏期短、成功率高、稳定性好,可以作为胶质瘤体内实验研究的动物模型。