毕赤酵母工程菌发酵生产重组Cu/Zn-SOD的工艺研究

系统考察毕赤酵母工程菌GS115表达重组铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)的发酵工艺参数,优化后5 L发酵罐上生产工艺为:采用BSM培养基,接种量5%(体积分数),发酵温度35℃,诱导期搅拌转速900r·min-1,pH值为6.0、维持溶氧(DO)水平为饱和值的20%以上.经过142 h发酵实验,SOD活力最高可达102.789 kU·mL^(-1),比优化前提高3.5倍.采用毕赤酵母工程菌能实现高效、大量制备优质动物来源的Cu/ZnSOD重组蛋白,具有良好的产业化潜力和广泛的应用前景.

鲭鱼罐头蒸煮液蛋白酶解产物的生物活性分析

以鲭鱼罐头蒸煮液为原料,采用生物酶解方法制备活性肽,以实现鱼罐头加工废弃液的高值化利用.研究结果表明,采用复合酶(碱性蛋白酶和胰蛋白酶)分段酶解,得到相对分子质量MW<1 ku的组分占50%,高于碱性蛋白酶(30%)和胰蛋白酶(28%)单酶水解效果.进一步采用超滤方法分离酶解产物,得到不同相对分子质量范围的3个组分,其中MW<1 ku的P1组分的抗氧化活性和ACE抑制效果最好.

海洋来源褐藻胶裂解酶分离纯化及酶学性质研究

以假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.zb7-4)发酵制备褐藻胶裂解酶粗酶液,采用弱阴离子DEAE交换层析分离褐藻胶裂解酶,分析纯化褐藻胶裂解酶Alg L的酶学特性.结果表明:Alg L的表观分子质量约为32 ku,比活力为(208.26±5.87)U·mg-1;其最适反应pH为7.0,在pH为6.0~10.0范围内稳定性较好,保温1 h仍能保持80%以上的相对酶活力;最适反应温度50℃,在40℃保温30 min,其残余酶活力高于80%;Cu2+、Cr3+、Co2+、Ba2+、Sr2+、Hg2+对该酶具有不同程度的抑制作用,Hg2+抑制作用最为明显;该酶具有较好的盐耐受性,在3 mol·L-1Na Cl反应体系中保温2 h,仍残余66%酶活力.动力学参数Km、Vmax、Kcat测定表明,该酶对聚古罗糖醛酸钠(PG)亲和力较高,为偏好聚甘露糖醛酸钠(PM)裂解作用的双功能酶.

不同条件下乳清蛋白水解物乳化性的变化及机理分析

在pH8.5、37℃、酶与底物质量比0.5%的条件下用胰蛋白酶水解乳清分离蛋白(WPI)5 h制备水解物(WPH)。通过控制环境条件,即添加不同盐(NaCl、KCl、CaCl_(2)、MgCl_(2)),改变离子强度(0.1 mol/L和1 mol/L),pH值(3~7)以及热处理来调控O/W界面处肽的组成。采用质谱法鉴定肽的组成,激光衍射法测量乳液的粒度分布及STEP技术测定乳液的稳定性,从而评估界面处肽的组成特性及相互作用对WPH乳化性的影响。结果表明,pH3时,因离子强度增大而引起的电荷屏蔽作用导致WPH乳液发生显著聚集,而pH7时离子强度对WPH乳化性的影响不显著,热处理则显著降低了其乳化性。此外,在WPH等电点(pH4)时,热处理显著提高了WPH的乳化性,尤其是添加CaCl_(2)的样品组。综合不同pH条件下析出肽的组成及乳化性分析,研究发现来自β-Lg的肽段f(41~60)、f(71~91)、f(78~101)对WPH的乳化特性有重要贡献。

产木聚糖酶海洋微生物的筛选与诱变育种

以自制木聚糖为初筛培养基的唯一碳源,从多个海洋来源样品中一共筛到60株有透明圈且形态各异的菌株,摇瓶发酵结果显示,38株具有产木聚糖酶能力,其中B659菌株产酶能力最高,酶活力为525.3 U·m L-1.结合B659菌株的形态特征和16S r DNA序列分析鉴定该菌株属于Bacillus属.对B659菌株进行紫外诱变,筛选得到酶活提高13.9%且稳定遗传的突变菌株G3-17;对G3-17菌株进一步进行微波诱变得到酶活较G3-17菌株高出11.6%且稳定遗传的突变菌株W1-40.对B659菌株和W1-40突变菌株进行发酵试验,72 h时W1-40菌株的酶活力达到645.2 U·m L-1,比B659菌株(517.9 U·m L-1)提高24.6%.

快速酶法制备低聚异麦芽糖工艺建立与优化

对多酶协同制备低聚异麦芽糖（IMOs）生产工艺进行研究,建立了以玉米淀粉为底物,使用耐高温α-淀粉酶进行液化,以α-葡萄糖苷酶、普鲁兰酶和β-淀粉酶同时糖化转苷制备IMOs的基本工艺。通过优化液化程度、糖化转苷过程作用温度和p H、糖化阶段α-葡萄糖转苷酶、普鲁兰酶和β-淀粉酶的添加量,形成了快速酶法制备低聚异麦芽糖的工艺。最优工艺如下：以25%（w/v）玉米淀粉为底物,液化还原糖含量（DE值）为20~30,糖化转苷温度为55℃,p H6.0,α-葡萄糖苷酶添加量为500~1000 U/g、普鲁兰酶添加量为0.9 U/g、β-淀粉酶添加量为500 U/g。结果表明：反应15 h可得到异麦芽二糖、异麦芽三糖和潘糖之和为49.09%的低聚异麦芽糖浆。本研究所建新工艺可以淀粉为原料快速高效制备IMOs,其有效组分明显高于现有生产工艺,制备周期也较现有生产工艺缩短70%以上,研究结果对现有IMOs生产技术的提升具有指导意义。

食品接触材料中酰胺类物质检测技术的研究进展

对食品接触材料中酰胺类化合物检测技术的研究进展作了综述。首先对酰胺类化合物对人体的危害以及世界上一些主要国家及地区对禁/限用此类物质的名称及限量的法规作了介绍,然后对此类物质的检测技术,特别是迁移测试条件的选择,以及主要的检测方法(包括气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱-串联质谱法)作了较系统的叙述。最后,对此类物质检测的发展方向也提出了见解及展望(引用文献26篇)。

交替假单胞菌BYS-2产褐藻胶裂解酶条件研究

以褐藻酸钠作为褐藻胶裂解酶产生菌初筛培养基唯一碳源,从鲍鱼养殖水样中分离获得一株产褐藻胶裂解酶的微生物,形态学和分子生物学16S rDNA鉴定结果显示,该菌株为交替假单胞菌Pseudoalteromonas sp.BYS-2.对该菌株进行产酶条件研究,获得最适产酶配方为:褐藻酸钠1 g·L^(-1),葡萄糖0.5 g·L^(-1),酵母膏10g·L^(-1),黄豆饼粉3 g·L^(-1),(NH_4)_2HPO_4 3 g·L^(-1),初始培养基pH8.0;最佳产酶条件为:接种量2%(体积分数),装液量50 m L/250 m L,发酵温度20℃,摇床转速200 r·min^(-1),在此条件下发酵24 h酶活力可达5.29 U·m L^(-1),比优化前(1.57 U·m L^(-1))提高2.37倍.

产琼脂糖酶海洋微生物的筛选鉴定及酶学性质研究

从红藻中筛选获得一株能产生明显液化现象并具有较高琼脂糖酶活力的菌株Ag-1,经生理生化实验和16S rDNA序列分析鉴定为弧菌属（Vibrio sp.）.酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度为50℃,40～50℃水浴保温1h可保持68％以上的酶活力;最适反应pH值为8.0,在pH 7.0 ～8.0保温1h可保持90％以上的酶活力,在pH 8.0 ～9.0保温1h仍可保持70％以上的酶活力,具有较好的耐热性和耐碱性;且该酶对琼脂底物具有高度专一性;K＋、Ca2＋、Mg2＋、Li＋和Fe3＋对琼脂糖酶活力具有激活作用,Mn2＋、Zn2＋和Cu2＋对琼脂糖酶具有抑制作用.酶反应动力学实验结果表明,该酶的最适底物浓度为8 mg· mL-1,动力学参数Km为0.58mg· mL-1,vmax为3.29 U·mg-1.

超声提取-气相色谱-质谱法同时测定尼龙等食品接触材料中5种酰胺类物质

对超声提取法从尼龙等食品接触材料中分离出5种酸胺类物质(丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、己内酰胺、油酸酰胺和硬脂酰胺)的条件进行了优化。预先将所分析的材料洗净晾干,剪成0.5cm×0.5cm的小块,并混匀。取此样品1.00g,用甲醇先后提取2次,每次加甲醇25mL,于25℃超声提取30min。将提取后过滤所得滤液合并,在45℃吹氮至近干。残渣用甲醇溶解并定容至50.0mL。取此溶液1.0mL,用0.22μm滤膜过滤,取其滤液按仪器工作条件进行气相色谱-质谱分析。选用Agilent HP5-MS色谱柱及在60~270℃区间按程序升温模式进行色谱分离,并按5种酰胺化合物的保留时间进行质谱测定。上述5种酰胺的质量浓度均在5~100mg·L^-1内与其对应的峰面积呈线性关系。测得其检出限(3S/N)为0.08~1.0mg·L^-1。以空白样品为基体,加入5种酰胺的混合标准溶液进行回收试验,测得回收率为90.2%~104%,测定值的相对标准偏差(n=6)为0.78%~1.7%。按本方法分析了4件实样,结果仅在尼龙炊具中检测到已内酰胺,质量分数为10mg·kg^-1,小于欧盟规定的迁移限量(15mg·kg^-1)。

解淀粉芽胞杆菌α-淀粉酶高活力突变体的创建与性质研究

为进一步提高解淀粉芽胞杆菌α-淀粉酶(Bacillus amyloliquefaciensα-amylase,BAA)发酵生产与应用性能,对BAA编码基因实施了体外随机突变,建立了含有2×10~4个转化子的BAA突变库。BAA编码基因的突变频率为56%,基因突变效率为2.8/kb DNA,错义突变26.8%;以平板筛选法和摇瓶发酵法对BAA突变库进行筛选,得到6个酶活力显著提高的突变体,其中突变体BAA28的酶活力提高最多,提高达37%;进一步分析突变体BAA28序列,发现其4个氨基酸残基发生突变,分别是:T341P、P348L、T356P和P362L,其中T341P和T356P位于无规卷曲结构中,P348L位于α-螺旋结构中,P362L位于β-折叠结构中。进一步制备与纯化BAA28,并比较分析其酶学特征,与野生型BAA相比,BAA28的离子依赖性、热稳定性发生了显著变化;BAA28的比酶活提高了约31%,κcat/Km值提高了92%。突变体BAA28较BAA在催化与应用属性上有了显著提升,可应用于后续中温α-淀粉酶高产新菌种的构建并可显著改善其工业应用性能。

乳酸对东方肉座菌β-葡萄糖苷酶的抑制动力学

为探讨糖化共发酵同步进行的过程中发酵产物对纤维素酶活力的影响,研究了乳酸对纤维素酶组分中β-葡萄糖苷酶(BG)活力的影响.结果显示:乳酸对BG活力有不同程度的抑制,该作用具有显著的浓度效应,其半抑制浓度IC_(50)=0.19mol/L;乳酸对BG的抑制类型是可逆的竞争性抑制,抑制常数K_I=0.149mol/L.应用底物反应动力学方法研究酶抑制动力学,建立了抑制动力学模型,发现乳酸对BG的影响是缓慢可逆失活的过程,底物对其有明显的保护作用,测得其正向速率常数k_(+0)为0.4L/(mol·min),逆向速率常数k-0为0.056min^(-1).该结果为纤维素糖化共发酵进程调控提供了理论依据.

地衣芽胞杆菌α-淀粉酶酸性pH稳定性提升突变体的生化特征

地衣芽胞杆菌α-淀粉酶(Bacillus licheniformisα-amylase,BLA)的pH稳定性在提升发酵生产过程特别是后提取工段的操作稳定性,提高产品得率,弱化酶成品贮存条件和延长货架期等方面具有重要价值。该研究对1株能够合成更好pH稳定性BLA的地衣芽胞杆菌B186 1-1的BLA进行了分子克隆、序列分析及性质研究,与模式菌株ATCC14580来源的BLA氨基酸序列相比发现,有4个位点的差异,包括:N4K、R134L、E243D和S320A。进一步克隆表达与纯化了该菌株的BLA,重组酶在80℃、pH 6.0~7.5下显示最高活性;在pH 5.0下放置1 h,该酶保留80%以上酶活力,而来源于菌株ATCC14580的BLA在此相同条件下仅保留约10%酶活力;通过3D结构模拟分析显示BLA中的差异性碱基与其pH稳定性存在相关关系。

Pichia pastoris细胞的酶法水解

以工业酶制剂生产中的废弃毕赤酵母细胞为对象,研究并建立了酶法制备酵母浸出物的新工艺。新工艺为:10%(w/v)废弃毕赤酵母菌体中加入β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和果胶酶,于50℃作用12 h;再加入中性蛋白酶,于50℃作用7 h;再加入DNA酶和RNA酶,于37℃作用4 h。离心收集上清液,真空冷冻(或喷雾)干燥获得酵母浸出物。运用这一技术,酵母细胞组分的溶出率达到66.2%,固形物收得率为65.7%。使用该研究制得的酵母浸出物培养重要工业微生物菌种,其支撑细胞生长繁殖的效果显著优于市售酵母粉。

海蜇胶原蛋白的制备及理化性质研究

以海蜇加工下脚料为原料,建立在中低温条件下,以柠檬酸为提取剂的胶原蛋白制备工艺,并对海蜇胶原蛋白的理化性质进行分析.结果表明,海蜇胶原蛋白的最佳酶法提取工艺条件为:提取温度15℃、柠檬酸浓度0.05 mol·L^(-1)、胃蛋白酶添加量1.5%、料液比1∶2.0(w∶V)和提取时间8 h,在该条件下胶原蛋白提取率为97.41%.SDS-PAGE分析结果表明,其可能结构为[α_1]_3;胶原蛋白中,甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸分别占总氨基酸的25.16%、7.62%和9.32%;傅里叶红外光谱分析表明,其保留了完整的三螺旋结构;黏度及溶解性特征显示,其等电点pI值在6~9之间;在pH值≤1和≥10范围,结构趋于不稳定,热变性温度为22.7℃,在大于1.0 mg·mL^(-1)的NaCl溶液中基本析出.

Alkalibacterium sp. SL3中α-半乳糖苷酶基因的克隆、表达和性质研究

以大布苏盐碱湖分离菌Alkalibacterium sp. SL3的DNA为模板,利用PCR扩增α-半乳糖苷酶基因(gal SL3),构建重组质粒pET-22b-gal SL3,转化至大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达重组酶(r Gal SL3).通过镍柱亲和层析分离纯化重组酶,并对纯化的重组酶进行性质研究.研究表明,纯酶r Gal SL3最适pH值为5.5,最适温度为55℃;该酶在pH值5.0～10.0保持90%以上的剩余酶活,在50℃有非常好的热稳定性.在0～1.5 mol·L^(-1)NaCl溶液中该酶的酶活基本不受影响,在3.0 mol·L^(-1)NaCl溶液中有很好的稳定性. Pb^(2+)、Ca^(2+)、Co^(2+)、Li^+、Na^+、K^+、Triton-100和β-mercaptoethanol等对重组酶的活性有明显的促进作用.该酶水解对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷的Km、vmax和kcat分别为(2.64±0.02)μmol·m L^(-1)、(454.55±0.59)μmol·(mg·min)^(-1)和(347.73±1.27) s^(-1).重组酶可水解蜜二糖和棉籽糖,不能水解瓜尔豆胶.

磁性壳聚糖微球固定化漆酶的制备及酶学性质研究

以Cerrena sp.HYB07菌株所产漆酶为研究对象,制备磁性Fe 3O 4-壳聚糖固定漆酶.磁性壳聚糖微球固定化漆酶制备的最优条件为:磁性Fe 3O 4纳米颗粒0.4μg·mL^-1、戊二醛质量浓度4 mg·mL^-1、交联时间12 h、给酶量160 U·mL^-1、固定化时间8 h.在此条件下,漆酶固定化率为78.03%,固定化漆酶活力为97.19 U·g^-1.酶学性质研究表明,固定化漆酶的最适反应pH值为3.0,最适反应温度为45℃.与游离酶相比,固定化漆酶的热稳定性有所提高.固定化漆酶用于蒽醌染料活性亮蓝脱色,具有良好的重复利用性,不仅染料脱色率优于游离酶,且在汞离子存在下也效果显著.

齿毛菌原生质体的制备与转化

探究菌龄、稳渗剂种类、溶壁酶质量浓度、酶解温度、酶解时间和再生培养基对齿毛菌原生质体制备及再生的影响,并利用PEG介导原生质体转化.结果表明:以0.6 mol·L^(-1)甘露醇为稳渗剂,20 mg·m L^(-1)溶壁酶于30℃酶解48 h菌龄的菌丝3 h,所得原生质体形成数最多,为1×108个·m L^(-1);所得原生质体在0.8 mol·L^(-1)蔗糖为稳渗剂的2号培养基中再生率最高,为0.1%; PEG介导原生质体转化,经潮霉素B抗性平板筛选获得2个转化子.实验建立的齿毛菌原生质体制备及转化体系,为其遗传操作及分子生物学研究奠定基础.

温泉来源地芽孢杆菌耐热α-淀粉酶基因的克隆表达及酶学性质研究

以Geobacillus sp.WQJ-1基因组DNA为模板,利用PCR扩增获得成熟α-淀粉酶基因amy WQJ,构建重组质粒p ET-28a(+)-amy WQJ,转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达.用镍柱亲和层析对粗酶液进行分离纯化,获得相对分子质量约为59 ku的重组酶r Amy WQJ.研究表明,该酶最适pH值为6.0,具有较好pH稳定性,最适温度为70℃;Ca^(2+)能提高该酶的热稳定性;Hg^(2+)、EDTA、SDS、Cr3+、Mn^(2+)、Cu^(2+)和Pb^(2+)对该酶活力具有不同程度的抑制作用,而Co^(2+)、Na+和β-Mercaptoethanol则具有促进作用.以可溶性淀粉为底物,该酶动力学参数Km为6.62 mg·m L-1,vmax为2 197.80μmol·(mg·min)-1;降解最适作用底物木薯淀粉的终产物为寡聚糖.

整体柱固定化胰蛋白酶反应器的设计及其在水解β-乳球蛋白中的应用

分别采用2.1、6.0μm的大孔有机整体柱为载体,制备固定化胰蛋白酶反应器(MITRs),比较不同方案对固定化得率及酶比活的影响.相较于氰基硼酸,以2-甲基吡啶硼烷为还原剂的固定化方案虽提高了酶的比活,但导致固载量减少了32%~50%.此外,孔径大小对酶的比活无显著影响.MITRs可有效水解β-乳球蛋白,且水解效率随着循环流速的增加而提高.其中使用2.1μm-MITR的水解产物主要为相对分子质量小于3 ku的小肽.在18次重复实用过程中,6.0μm-MITR表现出更高的稳定性,具有较高的重复利用性.