基于单克隆抗体的多元弧菌流式细胞术检测技术的研究

【目的】建立一种基于单克隆抗体的多元弧菌流式细胞仪检测技术。【方法】以副溶血弧菌表面蛋白r-OmpW的单克隆抗体(mAb)为基础,以细胞染色率为指标优化流式细胞仪检测副溶血弧菌时所需mAb的反应浓度和反应时间。通过菌落数对比评价在优化条件下流式细胞术方法的准确度、检出限和精密度。根据所建立的流式细胞术平台分析鉴定单抗对其它5种多元弧菌的特异性。【结果】流式细胞仪检测副溶血弧菌时所需r-OmpW单克隆抗体的优化反应浓度为20 mg/L,反应时间为60 min。当菌浓在104 107cells/mL范围时,检测值可信度较高,可特异性识别5种病原弧菌。对含不同菌体浓度的样品进行重复检测,变异系数均在7%以内。【结论】所建立的这种基于单克隆抗体的多元弧菌流式细胞仪检测技术可快速准确地检测多种病原弧菌。

肺炎球菌表面蛋白A(PspA)及其荚膜多糖交联物的免疫原性和交叉保护作用

分别采用肺炎球菌表面蛋白A(PspA)和PspA-荚膜多糖交联物免疫小鼠,研究PspA及其交联物的免疫特性.用酶联免疫吸附法(ELISA)检测抗原的免疫原性,用动物保护试验检验抗原对肺炎球菌6B,5,1,23F,19F型的交叉免疫效果.实验结果表明:肺炎球菌表面蛋白A及其多糖交联物表现出一定的交叉保护作用,具有较好的应用前景.

弧菌广谱性外膜蛋白抗原筛选及其单抗的交叉免疫原性研究

采用生物信息学方法分析几种病原性弧菌OmpK、OmpU和OmpW蛋白种间和种内的同源性,筛选高保守性蛋白OmpW.成功构建具备稳定分泌抗体IgG3的细胞株S5C10,鉴定其对5种弧菌具有特异性交叉免疫反应,而对9种非弧菌无免疫反应.研究结果显示OmpW可作为广谱性疫苗成分,其单抗可特异性检测多元弧菌.

中等分子量的κ-卡拉胶乙酰化方法的筛选

选择常规直接酰化、相转移催化酰化和离子交换-酰化共3种方法对3万中等分子量的κ-卡拉胶进行了乙酰化反应.气相色谱分析表明,采用常规直接酰化时反应难以进行;以四丁基溴化铵为催化剂的相转移催化酰化法因第一步的固液离子交换较难进行而只能稍许提高酰化度,也无实际应用价值;离子交换-酰化法却因能显著增强κ-卡拉胶在有机溶剂中的溶解性而大大提高了κ-卡拉胶的酰化度.红外光谱分析结果指出,只有离子交换-酰化法所获得的酰化κ-卡拉胶具有典型的乙酸酯吸收特征峰.研究集中揭示了中等分子量的κ-卡拉胶选择先经离子交换转型后酰化的方式较适宜.

肺炎链球菌外膜蛋白PspA和PsaA的免疫原性比较

目的 比较肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）表面黏附素A（PsaA）和表面蛋白A（PspA）的免疫原性.方法 电泳分析Sp6B亚型菌株的两种外膜蛋白基因及所编码蛋白相对分子质量的可变性,采用Western blot方法比较两种重组外膜蛋白对5种亚型菌株相应蛋白抗血清的交叉反应,采用酶联免疫吸附法（ELISA）分析两种外膜蛋白的抗体类型和抗体水平以及抗血清对5种亚型菌株的亲和性,以小鼠保护实验比较两种蛋白对5种亚型菌株的交叉保护作用.结果 两种蛋白产生的抗体亚型水平相当 PspA蛋白与其他亚型蛋白的交叉反应广泛性不如PsaA蛋白,只限于同一支系的蛋白之间 PspA抗体与病原菌具有可接近性,并具备交叉免疫保护作用.可作为一种更有效的抗原成分.结论 PspA对同家族同支系菌株攻击具有交叉免疫保护作用,可作为一种更有效的抗原成分.

肺炎球菌表面蛋白A(PspA)的克隆表达及交叉免疫作用

本工作从中国临床最常见的5种荚膜血清型肺炎链球菌(FY01,FY05,FY6B,FY19F,FY23F)克隆获得编码PspA蛋白N端α-螺旋区的基因片段。分别将5种PspA基因片段克隆到表达载体pET-27b(+)上,成功构建重组质粒pET-pspA,转化大肠杆菌BL21(DE3)。经乳糖诱导表达和亲和层析分离,获得高纯度重组蛋白。通过家族专属引物PCR的方法鉴定这5种荚膜血清型肺炎球菌的PspA蛋白所属家族,并进一步根据基因测序结果通过生物信息学方法鉴定了所属支系。FY01 rPspA、FY6B rPspA、FY19F rPspA同属于家族Ⅰ支系1,FY05 rPspA属于家族Ⅰ支系2,FY23F rPspA属于家族Ⅱ支系3。以FY01 rPspA免疫小鼠,在20μg/mL免疫剂量时抗体滴度达到1:210000,显示了重组蛋白较好的免疫原性。Western blotting交叉免疫反应性研究表明,抗FY01 rPspA抗血清与FY01 rPspA、FY6B rPspA和FY19F rPspA反应性较好,而与另外两种重组蛋白几乎无反应,提示PspA交叉免疫作用仅限于本支系内。动物保护实验表明,FY01 rPspA免疫的小鼠对FY6B、FY01两种菌的攻击具有较好的保护作用,对FY05、FY23F的攻击未见明显的保护作用。本研究成果对于研制高效肺炎球菌疫苗具有重要的指导意义。