LAMB3重组慢病毒载体的构建、包装和鉴定

目的 构建含有LAMB3基因的慢病毒表达载体,并感染HaCaT细胞,评价重组慢病毒载体提高LAMB3基因及蛋白表达的效果。方法 提取皮肤组织的总RNA,通过反转录方法扩增LAMB3基因,将其连入慢病毒载体pCDH-CMV中,在感受态细胞DH5α中扩增培养,并进行LAMB3基因的测序鉴定,将重组的慢病毒质粒转染293T细胞,浓缩纯化病毒液,感染HaCaT细胞并提取细胞的总蛋白和总RNA,用qPCR方法检测LAMB3 mRNA在感染病毒的HaCaT细胞中的表达,通过Western blot方法检测LAMB3蛋白在感染病毒的HaCaT细胞中的表达。结果 构建的慢病毒载体pCDH-CMV-LAMB3经测序分析证实基因序列正确。包装后的慢病毒滴度为108PFU/mL。qPCR方法检测到感染病毒的HaCaT细胞中,LAMB3基因在转录水平上有表达,Western blot方法检测到感染病毒的HaCaT细胞中,LAMB3过表达组与空白对照组相比,LAMB3蛋白表达量显著增加,LAMB3蛋白在翻译水平有表达。结论 本研究构建的携带LAMB3基因的重组慢病毒能够感染HaCaT细胞,并使其LAMB3基因及蛋白含量增加。