大柴胡汤加减对胆囊胆固醇结石湿热证小鼠FXR/FGF15/FGFR4信号通路的影响

目的:基于法尼酯衍生物X受体(FXR)/成纤维细胞生长因子15(FGF15)/成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)通路观察大柴胡汤加减对胆囊胆固醇结石(CS)湿热证模型小鼠的影响,以从方证对应的角度,探讨CS湿热证的分子生物学机制。方法:将48只6周龄小鼠随机分为空白组、模型组、大柴胡汤加减组(23.4 g·kg^(-1))和熊去氧胆酸组(0.12 g·kg^(-1)),每组12只;空白组作为对照,其他3组采用“内湿+外湿+高胆固醇致石饲料”的模式造模12周建立CS湿热证小鼠模型,大柴胡汤加减组和熊去氧胆酸组给予相应的药物灌胃,模型组和空白组给予等量的生理盐水灌胃,共干预4周。造模前后每组小鼠均要进行旷场行为学实验判断其活动度和精神状态,每周观察记录各组小鼠体质量、饮食量、皮毛、二便等一般情况变化以评判其湿热证候表现;干预结束后,取各组小鼠肝脏、胆囊组织进行苏木素-伊红(HE)染色,对血清中γ-谷氨酰基转移酶(GGT),碱性磷酸酶(ALP),总胆红素(TBIL)指标进行生化检测;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测胆汁中总胆固醇(TC),总胆汁酸(TBA)含量;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)及蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组小鼠回肠FXR,FGF15,以及肝脏FGFR4,胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)mRNA与蛋白表达水平。结果:与空白组比较,模型组小鼠胆囊增大,胆汁呈褐色浑浊状态,肉眼可见絮状沉淀;湿热证候表现明显;肝脏组织有明显的脂肪样变性,胆囊壁毛糙、增厚;血清肝功能指标ALP,GGT,TBIL水平均显著升高(P<0.01);胆汁内TC含量显著增多(P<0.01),TBA含量显著减少(P<0.01);回肠组织的FXR mRNA与蛋白表达均显著升高(P<0.01),FGF15 mRNA和蛋白表达均明显升高(P<0.05,P<0.01),肝脏FGFR4 mRNA和蛋白表达量均明显增多(P<0.05),CYP7A1 mRNA表达显著降低(P<0.01),蛋白表达量呈降低趋势但差异无统计学意义。与模型组比较,两用药组小鼠胆汁浑浊程度明显降低、其中大柴胡汤加减组小鼠胆汁更为澄澈;干预后大柴胡汤加减组小鼠湿热证候表现明显减轻;两用药组小鼠肝脏、胆囊病变程度均明显降低;两用药组小鼠血清肝功能指标ALP,GGT,TBIL含量均显著降低(P<0.01),其中就ALP,TBIL两指标的降低程度来看大柴胡汤加减组更为显著(P<0.01);两用药组小鼠胆汁内TC含量均显著减少,TBA含量均显著增多(P<0.01),大柴胡汤加减组变化趋势较熊去氧胆酸组更为显著(P<0.01);大柴胡汤加减组小鼠FXR mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01),FGF15和FGFR4 mRNA表达明显降低(P<0.05),蛋白表达水平也有降低趋势,CYP7A1 mRNA表达明显增多(P<0.05),蛋白表达有所升高;熊去氧胆酸组小鼠FXR,FGF15,FGFR4 mRNA与蛋白表达均有降低趋势,其中FXR mRNA表达明显降低(P<0.05),CYP7A1 mRNA与蛋白表达均有所增加。结论:大柴胡汤加减可明显改善CS湿热证模型小鼠的结石情况、肝功能、胆汁成分、胆固醇-胆汁酸代谢异常及湿热证候表现,其机制可能与调控胆固醇-胆汁酸代谢通路的关键因子FXR,FGF15,FGFR4,CYP7A1 mRNA和蛋白表达水平有关。