基于GISH的甘蔗与斑茅F_1染色体遗传与核型分析

斑茅在甘蔗育种的利用是现代甘蔗育种种质创新的热点，育种者期望把斑茅中优异的特性通过杂交渗透到甘蔗中。甘蔗与斑茅的F1是斑茅利用研究的难点也是基础。本研究利用基因组原位杂交技术（GISH）分析甘蔗与斑茅的F1染色体构成和核型，探讨甘蔗与斑茅F1染色体的遗传行为。GISH结果表明，甘蔗与斑茅杂交F1的染色体众数68-69条，其中40条来自甘蔗热带种Badila，28-29来自海南斑茅，未发现有染色体的交换或易位现象。参试材料大部分染色体都属于中部着丝点（m）的染色体，少数为近中部着丝点（sm），YCE95-41核型属2B型，其余的核型都属为1B型。甘蔗与斑茅的染色体按n ＋ n的方式传递给F1，本研究结果为斑茅种质在甘蔗育种中的利用及其杂交后代染色体细胞遗研究提供参考依据。

应用GGE双标图分析甘蔗品种(系)的产量和品质性状

采用GGE双标图分析7个甘蔗参试品种(系)在7个试点的产量和品质性状。结果表明,云蔗05-51(YZ05-51)为单茎产量高且稳定性强的品种,福农39(FN39)和柳城03-1137(LC03-1137)的单茎产量较高,但稳定性较差;福农38(FN38)、粤甘35(YG35)和新台糖22(ROC22)有效茎数较高,但稳定性较差;福农39(FN39)和云蔗05-51(YZ05-51)为蔗茎产量较高且稳定性强的品种,福农38(FN38)和柳城03-1137(LC03-1137)蔗茎产量高,但稳定性较差;福农39(FN39)和赣南02-70(GN02-70)为甘蔗蔗糖分较高且稳定性强的品种,云蔗05-51(YZ05-51)和福农38(FN38)甘蔗蔗糖分较高,但稳定性较差;福农39(FN39)为产糖量较高且稳定性较强的品种,福农38(FN38)、云蔗05-51(YZ05-51)和柳城03-1137(LC03-1137)的产糖量较高、但稳定性较差。云南瑞丽和云南临沧2个试点单茎产量的代表性和区分力较强;云南保山和广西来宾2个试点有效茎数的代表性和区分力较强;广西崇左和云南临沧2个试点蔗茎产量的区分力较强;广西百色和柳州2个试点甘蔗蔗糖分的区分力较强;广西百色和云南临沧2个试点产糖量的区分力较强。

甘蔗过氧化物酶基因ScPOD02的克隆与功能鉴定

过氧化物酶(POD)广泛存在于植物各种器官及其不同发育阶段,在植物生长发育及应对逆境胁迫中起重要作用。本研究基于前期转录组数据,从黑穗病菌侵染2 d的甘蔗抗黑穗病品种崖城05-179中分离到ScPOD02基因的cDNA(GenBank登录号为KU593507)及基因组DNA(GenBank登录号为KU593508)序列。其cDNA全长为1434 bp,ORF区为1047 bp,编码348个氨基酸,而基因组DNA全长为1558 bp,含2个外显子和1个内含子。系统发育树显示,ScPOD02与水稻Os Prx11(GenBank登录号为gi|55700889)属于同一个进化分支,推测ScPOD02属于酸性胞外分泌/细胞壁类型的I.1型过氧化物酶家族。将该基因克隆到原核表达载体p ET 32a上,转化大肠杆菌BL21,经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷诱导成功获得了大小约60 k D的融合蛋白,且该重组菌在聚乙二醇胁迫下的长势较对照快,表明其耐受干旱胁迫的能力更强。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析表明,除ROC22和YZ03-103外,ScPOD02基因在甘蔗抗病品种(YZ03-258、YZ01-1413、YT96-86和LC05-136)中受黑穗病菌诱导上调表达,但在中感(GT02-467和FN39)和感病(FN40)品种中的基因表达量基本维持不变或略有降低;此外,ScPOD02积极应答水杨酸、脱落酸、聚乙二醇及氯化钠的胁迫。通过农杆菌介导法在本氏烟叶片上瞬时表达ScPOD02,结果显示出较深的DAB染色,且过表达后本氏烟中的目标基因(ScPOD02)及过敏性反应(HR)标记基因(Nt HSR201和Nt HSR203)和乙烯合成依赖基因(Nt EFE26和Nt Accdeaminase)均上调表达。以上研究结果显示,ScPOD02具有参与甘蔗免疫应答及抗旱和抗盐害的潜在功能。

基于HA-GGE双标图的甘蔗试验环境评价及品种生态区划分

采用遗传力校正的GGE双标图(heritability adjusted GGE,HA-GGE),分析基因型(G)、环境(E)、基因型与环境互作效应(GE)对产量变异的影响,对14个试验点的分辨力、代表性和理想指数进行分析,并对这些试验点的生态区进行划分。结果表明,甘蔗试验环境对产量变异的影响大于基因型和基因型与环境互作;互作因素中以环境×基因型的互作效应最大,基因型×年份的互作效应最小。广东遂溪(E3)和广西崇左(E6)为最理想试验环境,对筛选广适性新品种和鉴别理想品种的效率最高;福建福州(E1)、福建漳州(E2)、广东湛江(E4)、云南保山(E11)、云南临沧(E13)、云南瑞丽(E14)为理想试验环境;广西百色(E5)、广西河池(E7)、海南临高(E10)、云南开远(E12)为较理想试验环境;广西来宾(E8)、广西柳州(E9)为不太理想的试验环境。根据HA-GGE双标图分析结果,可将我国甘蔗生态区划分为3个,即以广西百色、河池、来宾和柳州为代表的华南内陆甘蔗品种生态区,以云南保山、开远、临沧、瑞丽为代表的西南高原甘蔗品种生态区,涵盖福建福州、漳州、广东湛江、遂溪、广西崇左等试点的华南沿海甘蔗品种生态区。

甘蔗ScWRKY4基因的克隆与表达特性分析

WRKY是植物中特有的转录因子家族之一,在植物对生物和非生物逆境胁迫的应答反应中起重要调控作用。本研究基于课题组前期构建的甘蔗(Saccharum spp.)转录组数据库,从新台糖22(ROC22)中成功克隆到1个WRKY基因,命名为Sc WRKY4(Gen Bank登录号为MG852087)。序列分析发现,Sc WRKY4基因c DNA全长1265 bp,包含1个741 bp的完整开放读码框,编码246个氨基酸,该蛋白具有1个WRKYGQK保守结构域和C2H2锌指结构域,属于IIc类WRKY转录因子。生物信息学预测分析发现,Sc WRKY4蛋白为碱性的不稳定亲水性蛋白,不存在信号肽和跨膜结构域,蛋白二级结构元件缺少β螺旋。在本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达中,Sc WRKY4蛋白定位于细胞核。酵母杂交实验结果显示,Sc WRKY4不具有转录激活活性。实时荧光定量PCR分析表明,Sc WRKY4基因在甘蔗的根、叶、芽和皮中的表达量无明显差异,在蔗肉中的表达量最高,为对照蔗根的18.38倍;黑穗病菌侵染0~72 h,Sc WRKY4在抗病品种崖城05-179中下调表达,在感病品种ROC22中表达较稳定;受到外源激素脱落酸、水杨酸和茉莉酸甲酯以及非生物胁迫因子氯化钠和聚乙二醇胁迫后,Sc WRKY4基因均被诱导上调表达。上述研究结果表明,Sc WRKY4基因可能不参与甘蔗对黑穗病的抗性反应或在该防御方面起负调控作用,但积极响应甘蔗对盐和干旱胁迫的应答。

甘蔗CIPK基因的同源克隆与表达

CIPK （calcineurin B-like-interacting protein kinase）是植物特有一类的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,该蛋白在植物响应逆境胁迫中发挥着重要的作用,尤其与非生物逆境胁迫（干旱、高盐、ABA等）的信号传导密切相关。根据玉米CIPK15基因（EU957447.1,2247 bp）核酸序列保守区域设计1对同源克隆PCR引物,以甘蔗品种崖城05-179的cDNA为模板,通过RT-PCR扩增得到甘蔗CIPK基因的一条全长cDNA序列（GenBank登录号为 KM114052）。序列分析结果表明,甘蔗ScCIPK基因全长1782 bp,具有完整的开放阅读框（ORF,91~1631 bp）,编码513个氨基酸,该基因具有CIPK基因的2个特征结构域（Kc-like superfamily和AMPKA-C-like superfamily）。生物信息学分析显示该基因编码的蛋白定位于内质网,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为α-螺旋,含有多个保守功能域,主要参与中间代谢。实时定量PCR表达分析表明,该基因表达具有组织特异性,虽在甘蔗各组织中均有表达,但在芽中的表达量最高。该基因在PEG、NaCl、ABA、SA和MeJA的胁迫诱导过程中,受ABA胁迫后表达量最高,约为对照的5.3倍,推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关。

甘蔗脂氧合酶基因ScLOX1的克隆与表达分析

LOX属于脂氧合酶超家族(lipoxygenase superfamily),是脂肪氧化途径的重要因子,广泛参与植物生长发育的调节和对外界刺激的抵御。本研究基于甘蔗(Saccharumspp.)转录组数据库,通过RT-PCR技术,首次从新台糖22号(ROC22)蔗芽中克隆获得ScLOX1基因(GenBank登录号为MK106188)的cDNA全长序列。生物信息学分析显示,ScLOX1基因cDNA序列长度为2813 bp,开放读码框全长2664 bp,编码887个氨基酸,其编码蛋白的理论等电点为6.23,不稳定系数为39.77,亲水性平均值为-0.437,无信号肽和跨膜结构,但含有PLATLH2和Lipoxygenase活性位点,与高粱(Sorghum bicolor) LOX (XP002466613.1)的氨基酸序列相似性高达95.96%。预测ScLOX1基因的编码蛋白为酸性稳定亲水性非分泌蛋白,属于type I类非传统9-LOX。qPT-PCR分析结果显示,ScLOX1基因在蔗芽组织中特异性表达。接种甘蔗黑穗病菌(Sporisorium scitamineum)后, ScLOX1基因的表达量在抗病品种崖城05-179中短暂上升,但在感病品种ROC22中显著下降。分别对瞬时表达ScLOX1基因的本氏烟(Nicotiana benthamiana)植株叶片接种烟草茄病镰刀菌蓝色变种(Fusarium solani var. coeruleum)和青枯菌(Ralstonia solanacearum),表型观察、3,3’-二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine,DAB)染色和烟草免疫相关基因的表达情况分析显示,ScLOX1基因的过表达能够增强本氏烟对烟草茄病镰刀菌蓝色变种的防御,但对烟草青枯菌的作用与对照相比无明显差异。研究还发现,ScLOX1基因的表达受茉莉酸甲酯和水杨酸抑制下调,但受脱落酸、氯化钠和聚乙二醇诱导上调。以上结果为深入研究甘蔗ScLOX1基因的功能提供参考资料。

甘蔗CDK基因的cDNA全长克隆与表达分析

植物细胞周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,与周期蛋白(Cyclins)协同作用,是重要的细胞周期性调控因子。本研究从甘蔗受花叶病毒侵染的转录组数据库中获得一条与高粱(Sorghum bicolor)CDK基因(Gen Bank登录号为XP_002466536.1)高度同源的Unigene序列,通过RT-PCR扩增获得长度为1799 bp的甘蔗Sc CDK基因(Gen Bank登录号为KR258796)。序列分析显示Sc CDK基因含一个完整的开放阅读框(65~1603 bp),编码512个氨基酸,且具有CDK典型保守结构域,如ATP结合位点、磷酸结合位点及活化环A-loop。此外,生物信息学预测显示该基因编码的蛋白定位于细胞核,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为无规则卷曲,主要参与蛋白翻译。实时荧光定量PCR分析表明,Sc CDK基因的表达具有组织特异性,其在蔗芽上的表达量最高,其次是在蔗肉、蔗根、叶鞘和蔗皮中;在PEG、Na Cl和ABA的胁迫诱导过程中,Sc CDK均表现上调作用,且受ABA胁迫后表达量最高,约为对照组的1.9倍。推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关,同时受ABA的诱导,参与细胞周期分裂。

甘蔗葡聚糖酶ScBG1基因的电子克隆及序列分析

为了揭示甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因的结构特点和功能特性,从而为该基因的研究和应用提供基础。以水稻β-1,3-葡聚糖酶基因（U72255.1）为搜寻探针,运用电子克隆技术,获得一条甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因全长cDNA,命名为ScBG1,并对其进行生物信息学分析。结果表明：该基因的cDNA序列全长为1842bp,包含一个1488bp完整的开放读码框,编码495个氨基酸残基,属于糖基水解酶第十七家族,为疏水性蛋白,含有信号肽。将ScBG1与其他植物种的β-1,3-葡聚糖酶基因进行序列比对,发现该基因具有保守和典型的葡聚糖酶结构域,碱基序列的保守性为45%~73%。研究结果为该基因的实验克隆奠定基础,也为甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因的分子功能研究提供参考。