红麻HcKAN4基因克隆、表达及在类黄酮合成中的功能

MYB类转录因子KAN4(KANADI4)在红麻类黄酮合成和纤维发育中发挥着重要作用。本研究以红麻品种‘福红952’为材料,对HcKAN4基因进行克隆和表达模式分析,探讨TRV-VIGS诱导该基因沉默对类黄酮合成途径中关键酶基因表达量改变的影响。基因克隆显示,HcKAN4基因开放阅读框(open reading frame,ORF)全长为966 bp,编码322个氨基酸,包含一个MYB保守结构域。进化树分析发现,其与拟南芥和木槿KAN4s的亲缘关系较近。表达分析表明,该基因在红麻不同组织中均有表达,且转录水平随着植物生长而递增。VIGS诱导基因沉默显示,6株HcKAN4的转录水平显著下调,达到基因沉默效果。进一步实时荧光定量PCR检测发现,类黄酮合成相关基因HcCHS、HcF3’5’H、HcANS、HcANR的转录水平显著下调,分别是对照组的0.51、0.14、0.23、0.11倍,表明HcKAN4基因可调控红麻类黄酮生物合成相关基因。这些结果为阐明红麻MYB转录因子调控类黄酮合成提供了依据,同时为改善纤维品质提供了研究思路。

主要麻类作物基因组学与遗传改良:现状与展望

随着测序技术的发展,主要麻类作物(黄麻、红麻、苎麻、亚麻和工业大麻)参考基因组从2011年至2020年陆续完成测序,这标志着麻类作物科学已经进入基因组时代。文章首先详细概述主要麻类作物基因组测序。其次,评述了基于基因组学的麻类作物重要应用价值基因挖掘。基于参考基因组和转录组测序,大量关于纤维发育、响应非生物胁迫的候选基因被挖掘,以促进麻类作物纤维的物种特性和“不与粮食争好地”的逆境农业。同时不同麻类作物特异性状候选基因陆续被报道,如红麻雄性不育、亚麻种子含油量和大麻大麻素相关候选基因等。再次,麻类作物基因组测序完成为基于组学的麻类作物遗传改良提供可能:有助于麻类作物种质资源形成和演化机制研究,系统解析纤维产量、纤维品质、抗病耐逆等农艺性状形成的分子基础;有助于建立高通量基因型-表型数据库,挖掘优异基因资源与创制新种质;有助于创新并集成分子标记辅助选择、基因组选择、转基因等技术,建立高效的快速育种技术体系。宜选育高产高效、抗逆抗病、适宜轻简化机械化、优质专用的多用途麻类作物新品种,以满足麻类作物相关产业的市场需求,适应麻类作物生产方式。尽管已经获得重要基因以及位点的信息,但如何高效率利用已有基因资源对麻类作物进行遗传改良仍需面临一系列挑战,如成熟稳定的遗传转化体系、麻类作物基因编辑体系构建及基因组选择育种等。

专题导读:加强麻类作物基因组学研究,推动优异等位基因发掘及种质创新

麻类作物是指以收获茎秆韧皮纤维和叶纤维为主的作物,主要包括黄麻(Corchorus spp.)、红麻(Hibiscus cannabinus)、苎麻(Boehmeria spp.)、亚麻(Linum usitatissimum)、工业大麻(Cannabis sativa L.)与剑麻(Agave sisalana Perr.ex Engelm.),与粮、棉、油、菜并列为第五大作物群[1],其种植历史可追溯到远古新石器至尧舜时代。我国是麻类生产大国。2009年,作为50个农产品之一的麻产品被列入国家现代农业产业技术体系。2011—2020,以二代、三代测序技术为主体,以Hi-C等技术辅助,先后完成了主要麻类作物染色体级别的草图或参考基因组,这标志着麻类作物科学已经进入基因组时代。为加强主要麻类作物基因组学与遗传改良研究,《作物学报》以专栏形式集中刊发了8篇论文,方便相关研究工作者了解最新研究动态。

黄麻核心种质的遴选

遴选黄麻核心种质可为黄麻种质创新及新品种选育奠定基础。本研究以300份黄麻种质资源为基础,基于SSR分子标记和农艺性状考察,结合地理来源构建核心种质。结果表明,11个农艺性状变异系数变幅在13.06%~84.87%,表现出丰富的遗传多样性。按农艺性状聚类分析可划分为8个类群,按分子标记聚类可划分为10个类群。结合2个聚类分析、地理位置并按比例取样,建立一个由108份品种(系)组成的预选核心种质。采用44对SSR引物对其进行遗传差异分析,在遗传相似系数为0.65时,可把108份品种(系)分成圆果种和长果种两大类。根据遗传差异分析,剔除遗传相似系数大于或等于0.85的遗传冗余,获得84份品种(系)的核心种质,其中圆果种60份和长果种24份。比较84份核心种质与300份种质的农艺性状变异系数及Shannon-Wiener指数发现,两者之间相差不大,表明遴选的84份核心种质可以最大限度代表300份黄麻种质资源的遗传多样性加以利用和保存。

黄麻应用核心种质的DNA分子身份证构建

构建并研究黄麻应用核心种质是促进黄麻遗传育种和挖掘优异基因的必要途径。在300份黄麻种质资源的农艺性状观察统计基础上,构建了黄麻应用核心种质,包含61份品种(系),可划分为高产、优质、抗病等16种应用类型。为准确鉴定这61份应用核心种质,以46对核心引物为基础,筛选出12对荧光核心引物,采用荧光标记毛细管电泳分析这12对引物的多态性,共检测出140个多态性位点。将毛细管电泳得到的分子量数据以数字+英文字母方式编码,选取了12对荧光核心引物的组合,构建出该应用核心种质的字符串DNA分子身份证,进而构建了相应的条形码和二维码DNA分子身份证,可迅速被电子设备识别。这些结果可促进黄麻种质资源的高效利用及快速分子鉴定。

黄麻双生病毒 CoYVV 的分子鉴定和抗性种质筛选

越南黄麻黄脉病毒(Corchorus yellow vein Vietnam virus,CoYVV)是影响黄麻纤维品质和产量的双生病毒,其基因组含2个环状单链DNA(DNA-A和DNA-B)。鉴定黄麻双生病毒CoYVV并筛选抗病毒种质,不仅丰富对双生病毒分布和进化的认识,而且为黄麻抗性基因克隆奠定了基础。2018年福建省三明市福建农林大学洋中科教基地发现黄麻种质资源圃长果种黄麻福农5号疑似感染黄色花叶病。利用CTAB法提取该品种感病叶片DNA,通过PCR、滚环扩增及测序技术获得病毒基因组序列。通过同源序列比对和进化树构建明确该病毒与新旧世界双生病毒的关系。含有CoYVV DNA-A和CoYVV DNA-B侵染性克隆载体的农杆菌等比例混合,子叶注射法侵染具有代表性的7份长果种和7份圆果种黄麻品种(系),定期观察发病株数(病株率)并PCR检测接种黄麻的侵染率。PCR检测结果证实,福农5号病样感染了CoYVV,命名为CoYVV-FS。其DNA-A为2724 bp,DNA-B为2691 bp。进化分析表明,相较于旧世界菜豆金黄花叶病毒(begomoviruses),CoYVV-FS与新世界begomoviruses更近。农杆菌接种14份黄麻品种43 d时,统计病株率和侵染率。结果表明该病毒可以成功侵染13份黄麻品种,病株率和侵染率分别在0~60%和0~100%之间,说明该病毒在黄麻中具有较高侵染性。807元引马里的病株率和侵染率皆为0,表现为抗性种质;而巴长4号和印度墨绿子在接种30 d时产生黄脉、卷曲等典型的表型,表现出对CoYVV具有高度感病性。黄麻种植资源圃发现的CoYVV-FS与前期已报道的CoYVV属于同一分离物,它能侵染多数黄麻种质,在长果种黄麻上引起严重症状。

黄麻SSR标记与纤维产量性状的相关性

鉴定出与纤维产量相关性状连锁的SSR标记有助于黄麻纤维产量的分子标记辅助育种。本研究以311份黄麻种质资源为研究材料,通过2016—2018年表型鉴定,结合116对SSR引物扩增出397个SSR标记,利用SPSS软件对SSR标记与纤维产量性状进行相关性分析。结果表明, 311份黄麻种质资源9个纤维产量性状的变异系数范围为13.05%~76.78%,表现出广泛的遗传变异。农艺性状相关分析表明,这些性状间存在极显著相关,其中分枝高和节数的平均相关系数最高(r=0.931),其次是单株鲜皮重和单株鲜茎重(r=0.781)、单株干皮重与单株鲜皮重(r=0.779)。方差分析表明,节数、分枝数、株高以及分枝高等性状在不同年份间相对稳定,广义遗传力较高。进而通过皮尔逊相关法鉴定与纤维产量性状相关的SSR标记。每个性状与这些相关SSR标记逐步回归分析表明,与纤维产量性状显著相关的标记有6个,单个SSR标记的贡献率为3.9%~22.5%。这些结果将会加快黄麻设计育种进程。

中国黄麻炭疽病病原菌的分离鉴定及系统发育分析

炭疽病是严重影响黄麻纤维产量和品质的主要真菌性病害,明确炭疽病病原菌种类并测定其致病力有助于黄麻抗病育种和优异抗病基因资源挖掘。本研究从福建省福州市、福建省漳州市、河南省信阳市、安徽省六安市、浙江省杭州市、广西南宁市和湖南省长沙市等7个黄麻生产区采集黄麻炭疽病病原菌样本,分离纯化出92个菌株;rDNA-ITS区域的序列分析表明,其中11个为典型炭疽病病原菌。LSU区域的系统进化树和形态学特征鉴定显示,ZZ4、GX19等10个菌株为胶胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides),菌株CS3为黑线炭疽菌(Colletotrichum dematium)。人工接种的致病力测定表明,不同炭疽菌菌株致病力存在显著差异,其中胶胞炭疽菌菌株GX19致病力最强,表现为优势菌株。这些结果为黄麻炭疽病抗性基因位点挖掘和有效防治奠定了基础。

黄麻组培再生体系的研究

研究以4份黄麻(圆果种和长果种各2份)为试验材料,采用黄麻组培苗的茎段为外植体,诱导胚性愈伤组织,建立植株再生体系。结果表明:利用均匀设计法进行培养基配制,圆果种黄麻愈伤组织诱导效果优于长果种黄麻,4个黄麻品种的排序为179>梅峰4号(M4)>尤溪长果(YC)>广巴矮(GBA)。4个黄麻品种的最佳培养基如下,179:MS+0.53mg/L2,4-D+2.0mg/L6-BA,愈伤组织诱导率100%;梅峰4号:MS+2.0mg/LTDZ+0.5mg/L2,4-D,诱导率100%;尤溪长果:MS+2.0mg/LTDZ+2.0mg/L6-BA,诱导率63%;广巴矮:MS+2.0mg/LTDZ+2.0mg/L2,4-D+2.0mg/L6-BA,诱导率52%。以生长良好的愈伤组织为材料,采用正交设计配制培养基进行不定芽和不定根诱导分化,结果表明,4个品种的诱导与再生能力差异显著,圆果种依然优于长果种,其诱导效果黄麻179>M4>YC>GBA。筛选出对4个品种都最佳的不定芽培养基9号,适合179的13号,适合M4和GBA的14号不定根培养基。黄麻179和M4获得再生植株,YC诱导出不定根,GBA只诱导出不定芽。

黄麻内参基因筛选及次生细胞壁合成相关基因的表达分析

选择合适的内参基因进行校正和标准化,既能提高实时定量荧光PCR的准确性,也为分析黄麻次生细胞壁合成相关基因的表达模式奠定基础。本研究通过常用的内参基因,结合课题组已有的基因组数据和转录组数据,初步筛选出8个内参基因(CcTUBα、CcACT、CcDnaJ、CcTUBβ、CcUBQ、CcEF1α、CcUBC和CcUBI)。为验证这些候选内参基因的稳定性,以优良品种‘黄麻179’为材料,对种子萌发后14 d的根、茎、叶进行qRT-PCR分析。经Ct值的变异系数、软件geNorm和NormFinder的综合分析,确定表达最稳定内参基因为CcDnaJ,最佳内参基因组合方式为CcDnaJ+CcUBQ+CcUBI。通过种子萌发后10 d下胚轴、60 d和90 d茎皮的转录组数据分析次生细胞壁合成相关基因的表达模式,发现木质素合成基因Cc4CL1、CcCCoAOMT1的表达量在种子萌发后60 d茎皮最高,而种子萌发后90 d茎皮表现为下降;纤维素合成酶基因CcCesA4、CcCesA7、CcesA8和木聚糖合成基因CcIRX8、CcIRX9、CcFRA8的表达量在种子萌发后10 d下胚轴最高,而种子萌发后60 d、90 d茎皮的表达量均有下降,表明这些基因参与了黄麻纤维发育。以CcDnaJ+CcUBQ+CcUBI作为内参基因组合,qRT-PCR分析5个次生细胞壁合成相关基因,即Cc4CL1、CcCCoAOMT1、CcCesA4、CcCesA7、CcesA8,在种子萌发后7 d下胚轴和14 d茎的表达模式,发现这5个基因在种子萌发期后14 d茎的表达量均高于种子萌发期后7 d下胚轴,暗示着黄麻纤维的形成开始于7~14 d之间,同时表明CcDnaJ+CcUBQ+CcUBI的内参基因组合具有实用性。