人源性胃癌肿瘤组织移植免疫模型的建立与评价

目的利用免疫缺陷小鼠构建胃癌患者来源的肿瘤组织异种移植(PDX)的免疫模型,分析原代及传代后小鼠模型肿瘤组织中T细胞的浸润情况。方法取胃癌患者的新鲜肿瘤组织样本,移植至免疫缺陷小鼠皮下,建立免疫PDX模型。收集移植前后及再次移植传代后的肿瘤组织,苏木精-伊红染色分析组织形态结构的改变,免疫组织化学分析CD3 T细胞的变化。流式细胞术分析荷瘤小鼠外周血中人CD8^(+)CD3^(+)T细胞比例的变化。结果3例胃癌组织中,1例成功移植。在皮下移植及再次传代过程中,肿瘤组织仍可维持形态学和组织学结构特征。免疫组织化学结果显示,肿瘤组织浸润的淋巴细胞数量在初次移植后逐渐减少,再次移植后完全丢失。初次移植后,荷瘤小鼠外周血中人源的CD3^(+)CD8^(+)T细胞比例呈现先上调后降低的变化趋势,持续存在时间可达60 d。结论成功建立人胃癌免疫PDX模型,初次移植的肿瘤组织及小鼠外周血的T细胞可存活60 d以上,提示该模型可用于进行免疫机制研究及免疫相关药物的筛选。

人血浆中3-甲氧基肾上腺素和3-甲氧基去甲肾上腺素的萃取和浓度检测方法研究

目的:建立固相萃取-高效液相-电化学检测器联用法测定人血浆中3-甲氧基肾上腺素(Metanephrine,MN)和3-甲氧基去甲肾上腺素(Normetanephrine,NMN)浓度的方法。方法:采用固相萃取弱阳离子交换小柱萃取人血浆中的MN和NMN,用HPLC-ECD测定其浓度,并对其方法专属性、回收率进行研究。结果:MN线性相关系数R^(2)=0.9972,NMN线性相关系数R^(2)=0.9996;MN的提取回收率和方法回收率为84.34%和99.10%,NMN的提取回收率和方法回收率为90.55%和100.48%。结论:本课题建立的固相萃取-高效液相色谱-电化学检测器联用检测法检测人血浆中MN和NMN的浓度,操作简单,提取率较高,为临床人血浆中MN和NMN浓度检测提供方法学参考。

依托信息化平台建设深度探索高校实验室安全准入制度

以福建医科大学为例,依托全校统一的信息化平台建设对高校实验室安全准入制度进行“五位一体”深度探索,以“实验室安全环保知识考试系统”为代表的一体化平台抓好安全意识培养、安全知识考核、安全技能培训、重大危险源数据库的建立、保密安全意识强化等5个方面的工作,为其余高校提供借鉴。

抗PD-1抗体减轻阿尔茨海默病模型小鼠脑内病理损伤

目的探讨抗PD-1抗体对5×FAD阿尔茨海默病模型小鼠脑内病理损伤的影响。方法将小鼠分为3组,分别为WT+IgG组、5×FAD+IgG组和5×FAD+G4组。给予5×FAD+G4组小鼠腹腔注射抗PD-1抗体(G4),剂量为10 mg/kg,WT+IgG组和5×FAD+IgG组小鼠腹腔注射相同剂量的同型对照抗体hamster IgG。采用免疫组织化学法测定各组小鼠脑内Aβ水平、神经炎症(Iba1和GFAP)水平、突触标志蛋白PSD95水平;采用透射电镜检测小鼠脑内突触数量;免疫印迹法检测小鼠脑内PSD95和p-GSK3β水平。结果5×FAD+G4组小鼠脑内Aβ、GFAP及Iba1水平明显低于5×FAD+IgG组,突触数量、突触蛋白PSD95水平以及p-GSK3β水平明显高于5×FAD+IgG组。结论抗PD-1抗体可以降低5×FAD小鼠脑内Aβ沉积,减轻神经炎症和突触损伤。

基于生物膜干涉技术检测PDL1抗体与PDL1抗原的亲和力

生物膜干涉(biolayer interferometry,BLI)技术可对抗体与抗原的相互作用进行亲和力、动力学的全面分析。在抗体克隆筛选、动力学常数测定中对链霉亲和素(streptavidin,SA)生物传感器的需求量较大,但目前鲜有关于SA传感器重复利用的报道。基于BLI技术、再生SA生物传感器建立一种使用再生后的传感器检测PDL1抗体与PDL1抗原亲和力的方法。通过将生物素化的PDL1抗原偶联至SA生物传感器上,再与单链抗体、双价单链抗体、完整抗体和双特异性抗体这4类PDL1抗体结合,计算抗原抗体的亲和力常数,利用甘氨酸(10 mmol·L^(-1),pH 1.7)再生SA传感器,再次进行分子间相互作用力分析。结果显示,重复性相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均值为6.87%,批间重复性RSD为0.82%,稳定性RSD均值为6.13%,说明运用甘氨酸再生后的SA生物传感器测分子间的亲和力数据可靠、重现性好、稳定性高,再生后的传感器可继续用于本样品的实时、无标记的抗原抗体相互作用力分析。BLI技术可节省检测成本,为SA传感器的重复利用提供理论依据。

基于生物膜干涉技术的单克隆抗体高通量定量检测方法的建立

目的运用生物膜干涉(BLI)技术,建立高通量定量检测单克隆抗体浓度的方法。方法使用Octet Red 96分子相互作用分析仪,根据样品与protein A传感器结合后光相对干涉位移变化,检测抗体浓度,并对这种检测方法进行方法学考察。结果protein A传感器能特异性地与单克隆抗体结合,抗体工作标准品浓度在7.81~500μg/mL与结合速率呈良好的回归关系,相关系数R 2为0.9999;检测限为0.6μg/mL,定量限为2μg/mL;回收率为98.90%~100.40%;重复性的相对标准偏差(RSD)为2.17%,中间精密度的RSD为2.52%;45 d内protein A传感器重复使用60次,阳性对照值的RSD为3.7%;再生液pH变化±0.2、平衡液吐温-20比例变化±5%的RSD值为0.99%。检测温度与转盘速度的变化是影响样品定量检测的因素,检测结果与高效液相数据高度一致(R^2=0.90)。结论运用BLI技术能实现高通量定量检测单克隆抗体浓度,该方法具有样品适应性强、分析速度快、准确度高的优势,可用于单克隆抗体细胞株的筛选、排序及蛋白表达的检测与监控。

三裂叶蟛蜞菊的化学成分研究

从三裂叶蟛蜞菊全草甲醇提取物中分离得到1个新的化合物——蒲公英烷-14-烯-30-醛-3β-棕榈酸酯(1),以及6个已知化合物,分别鉴定为对映-贝壳杉-16-烯-19-酸(2)、16α-羟基-对映-贝壳杉烷-19-酸(3)、蒲公英赛醇(4)、β-香树脂醇(5)、1β-乙酰氧基-4α,9α-二羟基-6β-异戊酰氧基卤地菊内酯(6)、豆甾醇(7)。化合物结构结合红外、核磁、高分辨质谱等现代波谱技术进行鉴定。

代谢流分析在CHO细胞代谢研究中的应用进展

CHO细胞可进行正确的翻译后修饰,如蛋白折叠、糖基化,且其表达的重组蛋白可分泌至胞外,更便于后续纯化,已成为抗体药物的首选表达宿主。代谢流分析(metabolic flux analysis,MFA)又称代谢通量分析,可通过同位素示踪剂绘制胞内流动的代谢途径来量化这些代谢表型,其综合底物吸收及产物形成速率、生物合成、化学计量反应、中间代谢物的生物合成等数据,可为重新构建细胞代谢提供关键的量化信息。13C-MFA是以13C标记实验为基础的MFA,已成为研究CHO细胞工程改造后的变化及指导培养基和生物工艺优化的重要工具之一。本文就13C-MFA流程及近年MFA在CHO细胞代谢研究中的应用进展作一综述。

B7同源物4分子对乳腺癌细胞miRNA表达谱的影响

目的通过解析免疫调控分子B7同源物4(B7-H4)对乳腺癌miRNA表达谱的影响,探讨B7-H4介导肿瘤免疫逃逸和乳腺癌进展的潜在机制.方法采用miRNA测序分析B7-H4敲除或过表达的乳腺癌细胞系,筛选共同的差异miRNA;通过qRT-PCR验证差异miRNA,采用TargetFinder和TargetScan预测差异miRNA的靶基因,同时进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书数据库(KEGG)信号通路的富集;采用Kaplan-Meier plotter对关键miRNA及靶基因进行生存分析.结果B7-H4敲除后有415个miRNA发生显著变化,而过表达后有134个差异miRNA,通过叠加筛选到36个共同的差异miRNA,通过qRT-PCR验证筛选获得14个差异miRNA;对其进行下游靶基因预测,得到TP53AIP1、RAD52、CDH7、FOXA1、CDH2和ZEB1等涉及细胞增殖和转移功能的基因;富集分析发现,靶基因主要参与癌症进展相关的MAPK和Ras信号通路等,推测其可能参与乳腺癌的病理进展.结论B7-H4通过参与乳腺癌miRNA的表观调控,影响关键靶基因的表达,介导细胞增殖和转移,影响乳腺癌的进展.

靶向CD73/PD-L1双特异性抗体的制备及其体外抗肿瘤功能评价

目的制备同时靶向胞外5'-核苷酸酶(cluster of differentiation 73,CD73)与程序性细胞死亡配体1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)的双特异性抗体,并对其体外结合能力和杀伤能力进行评价。方法采用基因工程方法,将PD-L1单链抗体(single-chain fragment variable,scFv)插入至CD73单抗铰链区中,构建抗CD73/PD-L1双特异性抗体(BS-21),通过CHO GS表达系统进行筛选,获得高表达量细胞株,经Protein A及分子筛纯化后,采用分子排阻高效液相色谱法(size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography,SEC-HPLC)检测抗体纯度;流式细胞术检测抗体体外结合能力;通过外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)体外杀伤人肺癌细胞Calu 1检测抗体体外杀伤能力。结果经加压筛选获得了高产的细胞株;经纯化获得纯度为99.6%的双特异性抗体BS-21,该抗体能同时结合CD73和PD-L1分子;与anti CD73和anti PD-L1组相比,BS-21组显著提高免疫细胞对Calu 1肿瘤细胞的杀伤率(F均为30.36,P均<0.001)。结论双特异性抗体BS-21能同时降低CD73和PD-L1对免疫细胞的免疫抑制作用,具有较好的抗肿瘤功能。

共表达IL-15和CCL19的EGFRvⅢCAR-T细胞的构建和功能探究

本研究分析了共表达白细胞介素-15(interleukin-15,IL-15)和趋化因子配体19(C-C chemokine ligand 19,CCL19)的EGFRvⅢCAR-T细胞的功能特性及其体外特异性杀伤效果,旨在优化CAR-T细胞多项功能,提高靶向EGFRvⅢ的CAR-T细胞对胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)的治疗效果。通过基因工程技术获得重组慢病毒质粒,转染293T细胞获得慢病毒并感染T细胞获得靶向EGFRvⅢ的第四代CAR-T细胞(EGFRvⅢ-IL-15-CCL19 CAR-T)。利用流式细胞仪、细胞计数仪、趋化小室、凋亡试剂盒等检测了第四代和第二代CAR-T细胞(EGFRvⅢCAR-T)的CAR分子表达率、增殖、趋化能力、体外特异性杀伤能力及抗凋亡能力等。结果表明,与EGFRvⅢCAR-T细胞相比,EGFRvⅢ-IL-15-CCL19 CAR-T细胞能成功分泌IL-15和CCL19,具有更强的体外增殖能力、趋化能力以及抗凋亡能力(P值均<0.05),而体外特异性杀伤能力无显著差异。因此,靶向EGFRvⅢ且同时分泌IL-15和CCL19的CAR-T细胞有望提高胶质母细胞瘤的治疗效果,为临床试验提供一定的参考依据。

台湾红藜皂苷诱导乳腺癌4T1细胞凋亡的机制分析

探讨台湾红藜皂苷对小鼠乳腺癌4T1细胞增殖、凋亡和周期的影响。采用超声波辅助乙醇提取法和D101型大孔吸附树脂,提取和纯化台湾红藜皂苷;通过CCK-8法检测不同浓度的台湾红藜皂苷对4T1细胞增殖作用的影响;采用流式细胞术检测细胞周期分布及细胞凋亡情况;最后通过实时荧光定量PCR和蛋白印迹法检测细胞凋亡相关基因Bax和Bcl-2表达水平。结果显示,台湾红藜皂苷呈浓度依赖性地抑制4T1细胞增殖(IC50为123.9μg/mL);流式结果显示,低浓度台湾红藜皂苷可以促进细胞凋亡,但对细胞周期影响不大;其中,与凋亡相关的Bax mRNA和蛋白表达显著上调,而Bcl-2 mRNA和蛋白表达显著下调。这些研究初步表明台湾红藜皂苷对小鼠乳腺癌4T1细胞增殖具有抑制作用,能够促进其凋亡,其作用机制可能与Bax/Bcl-2信号通路有关。