利用EB病毒诊断鼻咽癌的研究进展

鼻咽癌是鼻咽上皮来源的恶性肿瘤,高发于我国南部地区。现认为EB病毒与鼻咽癌关系密切,参与鼻咽癌的发生、发展过程,因此通过检测EB病毒的相关组分以用于早期诊断鼻咽癌的研究十分活跃。现在简介EB病毒的生物学特性的基础上,就利用EB病毒进行鼻咽癌早期诊断方面的进展作一综述。

毛囊COL4A5基因扩增的方法学研究

目的探讨毛囊基因组在COL4A5基因扩增中的应用。方法对32例慢性肾病患者和12例健康体检者进行毛囊和全血COL4A5基因扩增,产物测序,比较两者扩增产物,并将测序结果与NCBI公布的标准序列进行比对。结果毛囊与全血COL4A5基因扩增产物长短一致,测序结果与NCBI公布的COL4A5基因标准序列完全相符,且扩增效率无显著性差异(P>0.05)。结论毛囊COL4A5基因扩增效果与全血等同。

一个遗传性胰腺炎家系中新发现的胰蛋白酶原基因突变

对1个遗传性胰腺炎(hereditary pancreatitis,HP)家系中6例成员和120例无亲缘关系健康人的胰蛋白酶原基因(protease serine 1,PRSS1)进行PCR扩增,产物纯化后测序,结合受检者的血清肿瘤标志物、糖尿病相关生化指标以及近亲属的一般临床资料进行分析。结果发现4例家系成员PRSS1基因3号外显子区136位碱基存在C→T杂合性突变,他们的基因型表现为野生型与突变型杂合现象,另外在先证者PRSS1基因的3号外显子区171位碱基还存在着一个同义突变点(C→T),而对照组和家系其他成员中未发现此两种突变,突变阳性患者表现为乳酸、糖基化血红蛋白和糖类肿瘤标志物(CA19-9、CA125)增高。因此,PRSS1基因3号外显子区136位碱基C→T杂合性突变与该家系遗传性胰腺炎有关,是该家系中遗传性胰腺炎的遗传易感因素。

以合成肽为抗原建立ELISA试验检测鼻咽癌患者EB病毒抗体的研究

目的:以人工合成肽为抗原基质建立酶联免疫吸附试验,检测EB病毒抗体。方法:以人工合成肽作为抗原,建立ELISA试验,并检测93例鼻咽癌患者和106名正常人的血清。结果:以临界值0.259为阳性判断标准,93例鼻咽癌患者血清中,阳性63例,敏感度为67.7%;106名正常人血清中,阳性8名,特异度为92.5%。结论:所建立的以合成肽为抗原基质的EB病毒酶联免疫试验适用于鼻咽癌患者的筛查。

福建省486例耳聋患者致聋原因及线粒体DNA突变分析

目的分析486例耳聋患者的致聋原因,探讨线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)突变与耳聋的关系。方法对486例耳聋患者进行病因学调查,并同时进行线粒体DNA1 555、3 243、7 445突变位点的检测。结果486例中发现家族遗传性聋126例(25.9%),药物性聋221例(45.5%),近亲结婚致聋39例(8.02%),高热或耳部疾病致聋76例(15.6%),不明原因致聋24例(4.9%);在486例耳聋患者中,mtDNA A1 555G突变阳性44例,突变阳性率为9.05%,其中32例为同质性突变,12例为异质性突变;检出1例mtDNA G7 444A突变;所有样本均未检出mtDNA A3 243G、mtDNA A7 445G突变。结论遗传因素和使用耳毒性药物是导致耳聋的重要原因,mtDNA A1 555G突变是常见的突变形式,是氨基糖苷抗生素致聋的重要原因。

4个非综合征耳聋家系中检出线粒体COI和COII基因的新变异

目的报道4个疑有母系遗传特征的中国非综合征耳聋家系的线粒体分子遗传学特征。方法应用限制性内切酶酶切和直接测序技术对先证者的线粒体基因序列进行分析,同时收集患者的相关临床资料。结果在2个非综合征耳聋家系的先证者中发现线粒体COⅠ和COⅡ基因上两个新变异形式(7250A>G和7774G>A)均为沉默突变(Thr→Thr和Thr→Thr),而位于COⅠ基因上的7196C>A(Leu→Leu)、7319T>C(Ile→Ile)和COⅡ基因上的7660A>G(Asp→Asp)为国外及汉族群体中已报道的3个多态性位点,其中COⅠ基因两个多态性位点为首次在畲族耳聋遗传家系中报道。这些突变或多态没有产生错义氨基酸,可能通过基因调控机制使tRNA代谢或线粒体功能产生缺陷,或者对氨基糖甙类药物易感而致聋。同时,在家系中未发现GJB2、MTO1基因及其他线粒体基因突变。结论 mtDNA7250A>G和7774G>A为汉族耳聋家系中新发现的线粒体基因突变形式,而mtDNA7196C>A和7319T>C是首次在畲族耳聋遗传家系中报道。

线粒体病的分子诊断

线粒体病是指由线粒体DNA（mtDNA）改变引起的一组独立的疾病。已经发现与mtDNA突变有关的疾病达270多种。研究表明,线粒体DNA结构、线粒体病的遗传有其独特的特点。近年来,有关这方面的研究取得了很大进展。现就线粒体DNA结构、线粒体病的遗传特点及线粒体病的实验诊断进展,尤其是分子诊断进展作一介绍。

胰蛋白酶原基因新突变胰腺炎患者的临床分子生物学特征

目的:分析1例胰蛋白酶原基因新突变慢性胰腺炎患者的分子生物学特征.方法:收集患者的一般资料,并对胰腺炎易感基因-胰蛋白酶原基因(protease serine 1,PRSS1)进行PCR扩增,纯化后直接测序.进行文献回顾,初步分析其发病原因.结果:慢性胰腺炎患者的胰蛋白酶原基因3号外显子区存在c.369C→T突变为杂合性突变,造成p.141 Ala→Pho.携带胰蛋白酶原基因突变的胰腺炎患者与普通的胰腺炎患者具有一样的胰腺酶谱规律.结论:PRSS1基因3号外显子的c.369C→T杂合性突变与胰腺炎有关.

福建汉族人群STR位点遗传多态性分析及其在亲子鉴定中的应用

目的调查福建汉族人群的 D5S818、FGA、D3S1358、THOI、DI3S317、D16S539、D2S1338、D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D19S433、vWA、TPOX、D18S51共15个STR位点多态性, 探讨 STR基因分析在亲子鉴定中的应用价值。方法应用PCR复合扩增和五色荧光Genescan技术对210个福建汉族个体和89例亲子鉴定案件的15个STR位点作基因分型。结果福建汉族人群15个STR位点的等位基因频率、基因型分布符合Hardy Weinberg平衡。D5S818、FGA、D13S317、D16S539、D2S1338、D8S1179、D21S11、D7S820、D19S433、vWA、D18S51位点属于高鉴别力、高杂合度、高信息含量的 STR位点。15 个 STR位点的累积个体识别能力 (DP)、非父排除率 (PE) 均为0 9999以上。89例亲子鉴定案例中, 否定亲权的 25 个案例中均至少有 3 个位点不符; 认定亲权的64例子中, 亲子关系指数 (RCP) 大于99 .73%。结论获得了福建汉族人群中15个STR位点的遗传多态性数据。应用这15个STR位点的等位基因分析, 能成功进行亲子鉴定, 显著提高亲子关系指数。

HBV感染的实验诊断进展及其个体化诊疗

有关HBV的研究取得了一系列重要进展:HBV侵入肝细胞的受体钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(NTCP)的发现;HBV感染及其结局的分子遗传学机制逐步得以阐明;借助自动化检测设备,临床实验室检测HBV血清标志物的能力大大提高。得益于以上基础和临床研究,在个体化医学时代背景下,一是应该厘清血清学检验的实验室检测路径,进一步明确新老血清标志物的诊断价值;二是应该结合HBV基因检测和宿主基因检测,开发新的检验项目,以预测HBV感染的转归和结局,预测CHB患者IFN-α或核苷(酸)类似物治疗的疗效。

建立实时荧光定量PCR检测新型隐球菌CAP10基因及其初步应用

目的建立FQ-PCR(real-time Fluorescent Quantitative PCR)系统定量检测新型隐球菌CAP10基因,为将其应用于新型隐球菌感染的诊断和疗效判断奠定基础。方法根据新型隐球菌5种血清型(A、B、C、D、AD)中同源序列设计引物和探针,PCR扩增CAP10基因片段,并将其克隆到pGEM-T Easy载体上,构建质粒标准品;建立FQ-PCR体系,优化反应条件,建立标准曲线,进行特异性、敏感性、重复性实验。结果FQ-PCR系统用于检测CAP10基因片段,敏感性为1拷贝数/μl,重复性好,批内变异系数(CV)为1.36%,批间变异系数(CV)为1.86%,特异性好,对临床其他常见脑膜炎病原体不出现特异性扩增曲线。结论成功建立了新型隐球菌CAP10基因FQ-PCR检测方法,结果稳定、准确,有望为判断新型隐球菌性脑膜炎疗效、预后提供新的依据。

EB病毒BMRF1基因原核表达载体的构建

目的克隆EB病毒早期蛋白p54的编码基因BMRF1,构建原核表达载体,为相应蛋白的表达和应用奠定基础。方法以含EB病毒的B95-8细胞培养上清为模板,PCR扩增出BMRF1基因。PCR产物经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆至原核表达载体pGEX-5T,用双酶切和DNA测序鉴定重组质粒。结果PCR扩增的特异性片段长度为1 233bp,以此构建的重组质粒pGEX-5T-BMRF1双酶切的片段大小与预期符合,重组克隆外源基因的测序结果与GenBank中的EB病毒BMRF1基因cDNA序列一致。结论成功构建了pGEX-5T-BMRF1原核表达载体。

多重PCR诊断线粒体突变聋病的临床应用价值

目的采用多重PCR和多重限制性内切酶法同时检测线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)1 555G、3243G7、445G三个突变位点,探讨多重PCR法在线粒体突变聋病中的诊断价值。方法收集311例耳聋患者外周血标本,提取DNA模板,以三对引物在同一PCR反应体系中进行多重PCR扩增;产物在同一体系中用三种相应的限制性内切酶分析,同时对扩增产物进行mtDNA基因序列测定。结果采用本法检测出mtDNA 1 555G点突变20例,7 444A点突变1例,结果与测序相符。结论多重PCR和酶切法可同时检测多个mtDNA突变位点,利用这一方法可快速简捷地诊断线粒体突变聋病,便于临床推广应用。

深静脉血栓形成患者亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T多态性分析

目的:研究亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)基因C677T突变与福建汉族人群深静脉血栓形成的关系。方法:采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对福建汉族103名深静脉血栓形成患者(DVT组)和106名健康体检者(对照组)进行MTHFR基因C677T突变检测,计算DVT组与对照组的基因型频率,研究该突变与深静脉血栓形成的相关性。结果:DVT组与对照组C/T杂合子频率分别为30.72%和22.64%,T/T纯合子频率分别为5.8%和4.7%,两组T等位基因发生频率差异比较无统计学意义。结论:MTHFR基因C677T多态性与福建汉族人群深静脉血栓形成无相关性。

核苷酸衍生物相关技术在分子诊断中的应用与展望

近年来,一些人工合成的核苷酸衍生物,包括肽核酸（peptide nucleic acid,PNA）、锁核酸（locked nucleic acid,LNA）、己糖醇核酸（hexitol nucleic acid,HNA）等开始在分子诊断领域中得以应用.与普通的核苷酸（DNA、RNA）一样,这些衍生物由A、T、C、G四种碱基组成,可通过碱基配对原则与互补的核酸序列结合.这些人工合成的核苷酸衍生物有诸多自身优势,如较高的热稳定性、酶抵抗性等.籍此,其可以明显改善普通分子生物学技术的性能特点,包括灵敏度、特异性、重复性等.譬如,利用3’端LNA修饰的引物可显著提高单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）检测的特异性,利用PNA夹止技术的抑制作用,可选择性扩增高野生背景中的少量突变.

转染CⅡTA基因上调小鼠树突状细胞表面MHC分子和共刺激分子的表达

目的探讨MHCⅡ类分子反式激活因子(MHC classⅡtransactivator,CⅡTA)基因对树突状细胞(Dendriticcell,DC)表面MHC-Ⅰ/-Ⅱ类分子及共刺激分子CD80、CD86的调节作用,为将树突状细胞应用于生物治疗奠定基础。方法从小鼠骨髓中大量扩增DC,用脂质体转染法将小鼠CⅡTA(mCⅡTA)基因转入DC中,用流式细胞术观察转染前、后DC表面MHCⅠ-/-Ⅱ类分子及CD80、CD86的表达。结果转染mCⅡTA基因使DC上MHC-Ⅰ/-Ⅱ分子的表达率由74.2%/66.7%明显上调为93.6%/91.4%;CD80/CD86的表达率由52.3%/60.5%明显上调为89.7%/91.5%(P<0.05)。结论转入mCⅡTA可使DC表面MHC-Ⅰ/-Ⅱ分子及CD80/CD86的表达率明显上调。本研究为将DC应用于肿瘤的生物治疗奠定了基础。

抗核小体抗体对诊断系统性红斑狼疮的意义

目的探讨血清抗核小体抗体(ANuA)的检测在系统性红斑狼疮(SLE)诊断中的意义。方法采用酶联免疫吸附试验检测40例SLE患者、20例其他结缔组织病患者、18例非结缔组织病患者及15例健康人血清ANuA。结果ANuA在SLE诊断中的敏感性和特异性分别为65.0%和96.2%。SLE组患者ANuA阳性率显著高于其他疾病对照组和正常对照组(P<0.01)。抗dsDNA抗体阴性的SLE患者ANuA阳性率为40%。结论ANuA对SLE诊断的敏感性高,特异性强,对抗dsDNA抗体阴性的SLE诊断有一定意义。

新生隐球菌毒力因子研究进展

新生隐球菌是条件致病性深部真菌,细胞免疫功能受损的人群易感,是隐球菌属的主要致病菌。近年来,由新生隐球菌感染引起的隐球菌病日益增多,因其症状重、治疗困难、病死率高而引起重视。有关新生隐球菌的毒力因子致病性方面的研究十分活跃,本文就这方面的研究进展作一综述。

胰腺炎发病的基因遗传背景在不同种族中的表现形式

目的研究基因因素在不同种族胰腺炎人群中的表现形式。方法回顾国外文献并且对部分汉族胰腺炎患者的DNA标本进行胰蛋白酶原基因(cationic trypsinogen,PRSS1)、胰分泌胰蛋白酶抑制剂基因Kazal 1型(serine protease inhibitors of the Kazaltype 1,SPINK1)、囊性纤维化基因(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)PCR扩增,产物纯化后直接测序,并收集不同基因型患者的临床资料(发病年龄、病程、并发症等)和实验室数据,进行统计和比较分析,与其他类型的胰腺炎进行对比。结果PRSS1基因存在多种突变形式:集中在欧美国家,主要为R122H(>100)和N29I(>50)两种突变形式,在亚洲人群中则是以A121T和C139S突变为主,而且是杂合性突变;SPINK1基因突变与胰腺炎相关性在各地均有报道,存在多种突变形式,主要为N34S;CFTR基因突变在北美和西欧人群中报道较多,而且不存在突变热点。结论胰腺炎相关的基因在不同的种群中呈现不同的突变热点或突变区域,相同肤色人种存在较为相似的突变形式和临床表现。