可溶性MICA在乳腺癌免疫逃逸中的作用

目的:观察乳腺癌患者血清中可溶性MICA(sMI-CA)表达情况,探讨sMICA在乳腺癌免疫逃逸中的作用。方法:ELISA方法检测乳腺肿瘤患者外周血sMICA的分泌。流式细胞术(FCM)检测sMICA及白细胞介素15(IL-15)对NK细胞表面NKG2D表达的影响。MTT法检测NK细胞对乳腺癌细胞的杀伤活性。结果:ELISA结果显示,血清sMICA含量在健康成年人血清中为阴性,在乳腺良性肿瘤患者血清中含量为(76.8±22.3)ng/L,在恶性肿瘤患者血清中含量为(205.36±71.27)ng/L,乳腺癌患者中血清sMICA含量高低与TNM分期呈正相关。应用含sMICA的血清与NK细胞共培养可明显下调NK细胞的杀瘤活性[(76.2±6.7)%vs(48.4±4.1)%],NK细胞表面NKG2D表达和上清中IFN-γ分泌量也下降。IL-15明显上调NK细胞表面NKG2D表达,增加培养上清IFN-γ分泌量和增强NK对MCF-7的杀瘤活性。结论:sMICA表达与乳腺癌TNM分期正相关,sMICA通过下调NK细胞NKG2D表达水平而降低NK细胞杀瘤活性,在肿瘤免疫逃逸中起重要作用。IL-15可以上调NK细胞NKG2D的表达并增强NK细胞杀瘤活性。

NKG2D配体在中晚期食管癌患者术后NK细胞免疫治疗中的作用

目的:探讨NKG2D配体MHC-I类相关分子A(MHC class I-related molecules A,MICA)在中晚期食管癌患者术后化疗联合NK细胞免疫治疗中的作用。方法:福建省肿瘤医院90例中晚期食管癌患者手术后,分为单纯化疗组40例、化疗联合NK细胞治疗MCIA阴性组(简称MICA-组)25例及化疗联合NK细胞治疗MICA阳性组(简称MICA+组)25例,比较其疗效。结果:与单纯化疗组及MICA-组相比,MICA+组CD3+、CD4+T细胞阳性率、NK细胞阳性率及CD4+/CD8+比率明显高于治疗前[(64.2±6.4)%vs(51.3±5.6)%,(39.8±8.2)%vs(29.5±3.2)%,(25.3±2.1)%vs(16.4±4.3)%,(1.4±0.5)vs(1.1±0.7);均P<0.05],T-reg细胞明显低于治疗前[(6.3±4.5)%vs(17.3±2.4)%,P<0.05]。3组疾病控制率及有效率无明显差异(P>0.05)。MICA+组KPS评分治疗后明显提高,MICA+组能明显改善化疗引起的白细胞减少、外周神经毒性症状,MICA+组疾病进展时间(time to progression,TTP)及总体生存时间(overall survival,OS)均明显延长(均P<0.05)。但单纯化疗组及MICA-组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:食管癌组织MICA表达阳性的中晚期患者进行化疗联合自体NK细胞能有效能有效提高免疫力,改善患者生活质量,并能延长生存期,且回输安全、不良反应小。

不同方式负载AFP抗原的DC诱导抗肝癌HepG2细胞免疫效应的比较

目的:比较AFP抗原以不同方式负载DCs对后者生物学功能的影响及体外刺激CTL对肝癌Hep G2细胞的杀伤作用。方法:分离健康供者外周血单个核细胞培养DC,分别用(A)人工合成AFP抗原肽、(B)Hep G2细胞裂解物、(C)Hep G2细胞分泌的外泌体(tumor exosome,T-exo)、(D)AFP抗原的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus expressingα-fetoprotein antigen,r AAV/AFP)致敏DC前体细胞及(E)未负载抗原的DC作为对照,经GM-CSF、IL-4及LPS联合诱导DCs分化成熟。流式细胞术检测r AAV/AFP病毒感染效率、各组DCs表型及其剌激初始T细胞的增殖效应,7-ADD/CFSE双染法流式细胞术检测各组DCs诱导CTL对AFP阳性Hep G2细胞的杀伤作用。结果:几种抗原负载方式均可诱导DCs成熟、促进CTL增殖及特异性识别并杀伤Hep G2细胞,但r AAV/AFP感染DCs后,其CD83、CD86、ICAM-1、CD58、CD40分子表达水平明显高于对照组(P<0.05),r AAV/AFP+DC组和Hep G2-Texo+DC组对Hep G2细胞的杀伤作用均分别显著优于其他抗原负载(AFP/peptide+DC、Hep G2 lysate+DC)组[(44.92±4.12)%vs(28.42±3.29)%、(24.28±1.79)%;(41.40±2.87)%vs(28.42±3.29)%、(24.28±1.79)%;均P<0.05)]。结论:r AAV/AFP高效感染DCs后能有效刺激初始T细胞增殖,并增强CTL对AFP阳性靶细胞的杀伤活性,而负载Texo的DCs也能诱导显著的抗肝癌效应,上述结果为基于DCs的肝癌疫苗的研发提供新的思路。

肝细胞肝癌组织浸润性淋巴细胞及其因子的表达

目的:分析原发性肝细胞癌(HCC)组织中浸润淋巴细胞的分类及细胞因子表达,探讨肝癌组织免疫微环境改变的意义。方法:收集76例原发性HCC的癌组织及非癌组织标本,应用流式细胞术及免疫组化的方法分别检测组织中免疫细胞的比例;运用流式微球阵列法(CBA)检测HCC组织和非癌组织中Th1/Th2类细胞因子,ELISA法检测TGF-1、VEGF的表达。结果:HCC患者中CD3+T细胞、CD4+Th细胞、Treg细胞及CD45RO+记忆性T细胞在癌组织中的比例均高于相应的非癌组织,而CD8+CTL细胞在癌组织中的比例较低;Treg细胞与Th细胞或CTL细胞水平呈负相关;癌组织中早期活化因子CD69在CD3+T淋巴细胞及NK细胞上的表达均低于非癌组织,而癌组织中晚期活化因子HLA-DR在CD3+T细胞表达的水平高于非癌组织。细胞因子IL-10、TGF-1及VEGF在癌组织中表达高于非癌组织。结论:肝癌组织微环境中,抗肿瘤效应性细胞比例下降,而抑制性细胞及其相关因子增加,引发肿瘤浸润淋巴细胞的免疫无能,导致肿瘤发生。

MICA分子在NK细胞杀伤乳腺癌中的作用

目的观察乳腺肿瘤细胞膜MHCⅠ链相关分子A(MHC class I chain-related gene A,MICA)及血清中可溶性MICA表达,探讨MICA在NK细胞杀伤乳腺癌中的作用。方法流式细胞术检测膜型MICA(mMICA)及NK细胞表面NKG2D表达,观察膜型MICA、可溶性MICA(sMICA)对NKG2D表达的影响;免疫组织化学检测膜型MICA及可溶性MICA的表达及分布;抗体封闭法观察膜型MICA与NKG2D相互作用。结果乳腺细胞膜型MICA在正常组织不表达,在良性肿瘤表达量为(38.5±7.5)%,恶性肿瘤表达量为(53.2±5.6)%。可溶性MICA含量在健康成年人为阴性,在乳腺良性肿瘤患者血清中含量(76.8±22.3)pg/mL,在恶性肿瘤患者中含量(205.36±71.27)pg/mL。经NKG2D或MICA抗体封闭后,NK细胞的杀瘤活性显著减弱。含可溶性MICA的血清可明显下调NKG2D的表达。结论大部分乳腺肿瘤细胞膜都有MICA的表达,可作为乳腺肿瘤相关性抗原。膜型MICA与NKG2D的相互识别在介导NK细胞抗乳腺癌中起重要作用,而可溶性MICA通过下调NKG2D表达介导肿瘤免疫逃逸。

食管癌中MICA的表达及其意义

目的:观察食管癌细胞株组织膜MHCⅠ链相关分子A(MHC class Ⅰ chain-related gene A,MICA)及血清中可溶性MICA表达,探讨食管癌中MICA的表达及其临床意义。方法:流式细胞术检测膜型MICA(mMICA)及NK细胞表面NKG2D表达,ELISA方法检测乳腺肿瘤患者外周血可溶性MICA(sMICA)的分泌。分组实验分析可溶性MICA(sMICA)对NKG2D表达的影响。结果:食管细胞膜型MICA在食管癌旁组织无表达,在31.7%食管癌组织有表达,表达量为(42.2±3.6)%。可溶性MICA含量在健康成年者为阴性,食管癌患者中74.67%阳性,含量为(1977.30±292.67)ng/L。食管癌患者中血清sMICA含量高低与TNM分期呈正相关,远处转移组比无远处转移组高(P<0.05),但和病理类型表达无差异。含可溶性M!CA的血清可明显下调NK细胞NKG2D的表达,从而降低NK细胞对食管癌细胞株ECA-109的杀伤活性。结论:食管癌细胞膜表达MICA,可作为食管肿瘤相关性抗原。而可溶性MICA含量高低与TNM分期呈正相关,可通过下调NK细胞NKG2D表达介导肿瘤免疫逃逸。

脐血干细胞向巨核细胞分化后信号转导基因的表达(英文)

背景:造血干细胞具有多向分化的潜能,在合适的造血生长因子和系特异性生长因子的诱导下,可分化成巨核细胞。在体外诱导CD34^+造血干细胞向巨核细胞分化可导致许多基因尤其是信号转导基因表达的变化。目的:观察脐血干细胞向巨核细胞分化后信号转导基因的表达,拟从基因水平验证其对巨核细胞分化发育的调控。设计:开放性实验。单位:福建省肿瘤医院肿瘤免疫学研究室。材料:无菌条件下应用血袋采集法收集足月正常分娩的胎儿脐带血60～145 mL,产妇及家属自愿捐献。VarioMACS免疫磁性吸附柱分离装置,CD34+Isolation Kit;SCGM无血清培养基;CD单抗;细胞因子。人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片V2.0;LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪。实验经医院伦理委员会批准。方法:实验于2005-07/2006-06在福建省肿瘤医院肿瘤免疫研究室及北京博奥生物芯片有限公司完成。分别收集同一份脐血分化培养前CD34^+细胞和培养后CD41^+细胞,提取总RNA。逆转录合成和纯化cDNA探针,以Cy3-dCTP标记培养前CD34^+细胞,以Cy5-dCTP标记培养后CD41^+细胞标记的DNA溶于30μL杂交液中,42℃过夜。主要观察指标:应用基因芯片技术比较造血干细胞与分化的巨核细胞信号转导相关的基因表达差异。根据基因芯片结果,选定17个表达差异基因用RT-PCR作进一步验证。结果:芯片分析结果显示,共筛选出3522个差异基因,其中上调基因1705个,下调基因1817个。3522个差异基因中,与细胞信号相关的基因有343个,与转录调节相关的有150个,与分化相关的有21个。其中,CD61基因的表达增加了369.83倍,CD41基因的表达增加27.38倍,PF4基因的表达增加24.06倍;促分裂原活化蛋白澈酶s、G蛋白偶联受体、RAS家族相关的基因多数表达上调;与STAT通路相关的基因中,SOCS1、JANUS激酶表达上调,STAT5A表达下调。对选定的17个表达差异基因用RT-PCR作进一步验证,以GAPDH为内对照,结果与芯片检测完全一致。结论:血小板生成素等造血生长因子可能主要通过G蛋白偶联受体-Ras-促分裂原活化蛋白激酶途径,促进脐血干细胞向巨核细胞系增殖、分化。

生长因子受体结合蛋白-2抑制肠癌细胞HT29增殖

目的研究Grb2 shRNA转染对肠癌细胞HT29增殖相关信号通路的影响,探讨以Grb2为肠癌治疗靶点的可行性。方法应用shRNA慢病毒质粒系统,将Grb2 shRNA转染至293T细胞,获得5株不同序列Grb2 shRNA慢病毒颗粒,并感染肠癌HT29细胞,分别获得的5株感染Grb2 shRNA慢病毒颗粒的肠癌HT29细胞系为实验组(即感染Grb2 shRNA的细胞HT29/shGrb2-69、HT29/shGrb2-70、HT29/shGrb2-71、HT29/shGrb2-72、HT29/shGrb2-73),以eGFP shRNA慢病毒感染肠癌HT29细胞为阴性对照组。MTT法检测细胞增殖情况,RT-PCR检测Grb2 mRNA表达,Western blot检测Grb2、P42/44 ERK、磷酸化P42/44 ERK、Akt、磷酸化Akt(P-Akt)和STAT5等信号通路分子表达的改变。结果感染shGrb2病毒72 h,HT29/shGrb2-69、HT29/shGrb2-73两株细胞在mRNA和蛋白水平均出现抑制现象。HT29/shGrb2-69、HT29/shGrb2-73细胞在感染后24h A值分别为0.176±0.045,0.186±0.013,感染48 h后为0.347±0.048、0.382±0.041均显著高于空白对照、阴性对照(P<0.001),72 h为0.934±0.038、0.983±0.205高于空白对照、阴性对照(P<0.01);感染后72 h,phospho-P42/44 ERK、Akt、phospho-Akt明显下降,而ERK、STAT5表达不受影响。结论在HT29细胞,Grb2 mRNA和蛋白水平上明显抑制,可诱导HT29细胞增殖和相关信号传导通路分子表达下调。

CXCR4基因表达增强K562细胞的趋化作用

目的构建高表达人CXCR4蛋白的白血病细胞系并测定CXCR4基因对其侵袭转移能力的影响。方法从外周血淋巴细胞中提取基因组RNA,用RT-PCR扩展编码CXCR4基因片段,将CXCR4基因定向克隆到含有双启动子的真核表达载体PBudCE4.1,采用酶切和序列测定方法鉴定。将所构建的重组质粒用脂质体2000转染K562细胞,Zeocin筛选阳性克隆。流式细胞术和RT-PCR对阳性克隆进行鉴定;用Transwell板检测转染与未转染CXCR4的K562细胞对趋化因子SDF-1趋化活性。结果成功构建编码CXCR4基因的真核表达质粒PBudCE4.1/CXCR4,经转染入K562细胞,筛选获得能稳定高表达人CXCR4蛋白的K562/CXCR4细胞;K562/CXCR4细胞对SDF-1的趋化能力较K562细胞明显增强。结论成功构建了转染人CXCR4基因的白血病细胞系,为进一步研究白血病细胞髓外浸润的分子机制奠定基础。

Grb2的抑制对K562细胞侵袭和迁移能力的影响

目的探讨Grb2的抑制对K562细胞侵袭和迁移能力的影响。方法 pSilence-4.1CMV-Grb2原核表达载体的构建并应用脂质体介导法将其转染至人慢性髓细胞性白血病细胞K562,后以潮霉素筛选稳定表达siRNA的细胞克隆。应用Western blot和RT-PCR技术,检测转染Grb2siRNA重组质粒的K562细胞(K562/pSilence-4.1CMV-Grb2)、转染空载体细胞(K562/pSilence-4.1CMV)和未转染细胞(K562)中Grb2的表达情况。Transwell小室体外迁移和侵袭能力实验测定各组细胞的迁移和侵袭能力。结果成功构建了pSilence-4.1CMV-Grb2原核表达载体,并获得稳定表达siRNA原核载体的细胞株K562/pSilence-4.1CMV-Grb2/405、K562/pSilence-4.1CMV-Grb2/541及K562/pSilence-4.1CMV-Grb2/215;与其他组比较,K562/pSilence-4.1CMV-Grb2/405细胞Grb2mRNA和蛋白的表达水平显著降低并伴随着其迁移和侵袭能力的下降。结论 Grb2的抑制可明显降低K562细胞侵袭和迁移能力。提示针对Grb2的siRNA有望成为抑制肿瘤转移的基因治疗的一种新途径。

原发性肝癌免疫治疗现状及展望

免疫治疗已成为继手术、放疗、化疗之后的第四种肿瘤治疗手段,在肝癌的综合治疗方案中,免疫治疗在提高肿瘤治愈率,改善患者生活质量,延长生存期方面起重要作用,显示良好应用前景。文章对肝癌的免疫治疗现状及发展作一论述。

MHC-Ⅰ类相关分子A表达在食管癌患者术后自然杀伤细胞免疫治疗中的作用

目的探讨MHC—I类相关分子A（MICA）分子表达与早期食管癌患者术后自然杀伤（NK）细胞过继免疫治疗的相关性，并分析MICA表达在NK细胞治疗中的意义。方法100例食管癌患者分为单纯手术组40例、MICA阴性NK细胞治疗组（MICA一组）30例及MICA阳性NK细胞治疗组（MICA＋组）30例，分别于手术前及手术后60d检测患者外周血CD3＋、CD4＋、CD4＋／CD8＋、NK细胞比例、调节性T细胞（Treg细胞）比例、Thl／Th2／Thl7细胞因子水平、血清抗体IgA、IgM、IgG以及肿瘤标志物CEA、SCC、CAl99、CYFRA21．1等的变化，初步评价患者近期疗效。结果MICA＋组患者外周血CD3＋、CD4＋、NK细胞阳性率及CD4＋／CD8＋比例明显高于治疗前[（68.3±7．6）％比（56．2±4．1）％，（39．8±8．2）％比（30．8±4．7）％，（22．2±4．7）％比（18．7±5．5）％，（1．49±0．30）比（1．15±0．61）；均P〈0．051，Treg细胞阳性率明显低于治疗前[（8．1±4．0）％比（13．4±4．5）％，P〈0．05]，CD；细胞阳性率治疗前后差异无统计学意义[（26．9±6．2）％比（27．8±7．1）％，P〉0．05]。MICA＋组患者外周血中Thl类细胞因子（包括IL-2、IFN-1和TNF-α）水平增高，Th2类细胞因子（IL-4、IL-6、1L-10）水平降低（P〈0．05），但Thl7细胞因子水平差异无统计学意义（P〉0．05）。同时提高IgA、IgM、IgG含量，但NK细胞治疗前后肿瘤标志物CEA、SCC、CA199、CYFRA21-1差异无统计学意义（P〉0．05）。结论早期食管癌组织MICA表达阳性患者进行NK细胞过继免疫治疗能有效提高细胞免疫及体液免疫水平。

血清蛋白质谱诊断模型在乳腺癌辅助诊断中的价值

目的 建立乳腺癌的血清蛋白质谱诊断模型,评价其在乳腺癌辅助诊断中的价值.方法 应用表面增强激光解析电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）技术检测113例乳腺癌患者、103例乳腺良性肿瘤患者及92例健康女性的血清蛋白质谱,采用Biomarker Pattern（BPS）软件分析蛋白质谱,建立分类树模型,然后对模型进行盲筛验证.结果 比较乳腺癌患者与健康女性的血清蛋白质谱,筛选出12个差异蛋白质峰.经验证,所建立的分类树模型Ⅰ诊断乳腺癌的灵敏度为91.9%,特异度为81.2%.比较乳腺良性肿瘤患者与健康女性的血清蛋白质谱,筛选出11个差异蛋白质峰.经验证,所建立的分类树模型Ⅱ诊断乳腺良性肿瘤的灵敏度为87.9%,特异度为81.2%.比较乳腺癌与乳腺良性肿瘤患者的血清蛋白质谱,筛选出2个差异蛋白质峰.经验证,所建立的分类树模型Ⅲ诊断乳腺癌的灵敏度为81.8%,特异度为78.3%.应用这些差异蛋白及分类树模型,分别对93例CA15-3阴性乳腺癌患者与36例乳腺良性疾病患者的血清、20例CA15-3阳性乳腺癌患者与36例乳腺良性疾病患者的血清进行盲筛,诊断乳腺癌的敏感度和特异度分别为80.6%和91.7%、75.0%和91.7%,明显高于传统的乳腺癌标志物CA15-3,而CA15-3阴性与CA15-3阳性乳腺癌未见明显的差异蛋白质峰.结论 应用SELDI-TOF-MS技术可筛选出乳腺癌、乳腺良性肿瘤和健康女性血清蛋白质谱存在的差异蛋白质峰,据此建立的诊断模型可用于乳腺癌的辅助诊断.

流式细胞微球阵列术检测肝癌组织中细胞因子水平及其意义

目的应用流式细胞微球阵列术(CBA)检测原发性肝细胞癌组织中细胞因子的表达水平,探讨细胞因子改变在肝癌组织免疫微环境中的意义。方法收集36例原发性肝细胞癌的癌组织及非癌组织标本,采用流式细胞术检测组织中浸润免疫细胞的比例,CBA检测肝癌组织和非癌组织中Th1(IL-2、TNF-α、IFN-γ)、Th2(IL-4、IL-6、IL-10)、IL-17A细胞因子水平,并比较分析。结果肝癌组织中IL-6、IL-10和TNF水平分别为(292.49±325.29)pg/ml、(6.09±3.88)pg/ml和(9.55±5.60)pg/ml,比正常非癌组织的(6.82±2.69)pg/ml、(2.99±0.60)pg/ml和(3.50±0.77)pg/ml显著升高(P均<0.01),肝癌组织IL-2、IL-4及IL-17A水平分别为(4.73±0.26)pg/ml、(3.25±0.26)pg/ml和(2.05±0.29)pg/ml,显著低于正常非癌组织(P均<0.01)。而IFN-γ水平虽然较正常非癌组织高,但差异无统计学意义(P>0.05)。肝细胞癌患者CD3+T细胞、CD4+Th细胞在癌组织中的比例均高于相应的非癌组织,而CD8+细胞在癌组织中的比例较低(P<0.05);不同病理分期的细胞因子水平无统计学差异(P>0.05)。结论肝癌组织中抗肿瘤效应性细胞比例下降,Th1/Th2比例失衡,且向Th2方向漂移,导致肿瘤的发生、发展。肝癌组织微环境中细胞因子水平与肿瘤病理分期无关。

大肠癌组织中核转录因子-κB p65及磷酸酶和张力蛋白同源缺失基因的表达及意义

目的探讨大肠癌中核转录因子NF-κB p65和抑癌基因磷酸酶和张力蛋白同源缺失基因(PTEN)的表达及意义。方法采用免疫组织化学方法检测59例大肠癌组织中,NF-κB和抑癌基因PTEN的表达。结果 59例大肠癌组织中NF-κBp65和PTEN阳性表达率分别为44.1%(26/59)和37.3%(22/59)。两者表达呈负相关(P<0.05)。大肠癌组织中PTEN的表达与肠周淋巴结转移显著相关(P<0.05),NF-κBp65核表达与肠周淋巴结转移无关(P>0.05)。不同病理类型、肿瘤侵袭程度、性别、年龄的大肠癌组织中,NF-κBp65核表达与PTEN的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论 NF-κBp65的激活与PTEN基因缺失均参与了大肠癌的发生发展及演变。