雷公藤提取物在神经免疫性疾病中的药理效应和机制研究进展

雷公藤提取物具有显著的抗炎和免疫抑制活性,临床上被广泛用于类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的治疗,在抗肿瘤和抗器官移植排斥方面也有很强的作用。随着免疫炎症机制在阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化等神经变性疾病中的研究进展,抗炎和免疫调节也成为延缓这些疾病病程的重要策略。新近研究发现,雷公藤提取物能促进神经元的存活和轴突伸展,促使受损的脑功能恢复,从而延缓多种神经变性疾病的病理生理进展。药理研究表明,雷公藤提取物的药理效应与其抑制过度活化的胶质细胞产生的神经炎性毒性、抗氧化、调节神经钙通道、调节T细胞功能及其神经营养作用有关。分子水平的研究显示,对NF-κB信号的抑制是雷公藤提取物主要的靶点。因而,雷公藤提取物在神经免疫炎症性疾病中具有很好的开发价值和临床应用前景。

血管性痴呆大鼠行为学及海马胆碱能神经元的变化

目的 :研究血管性痴呆大鼠海马胆碱能神经元及行为的变化。方法 :将大鼠随机分成手术组及对照组 ,手术组制作血管性痴呆大鼠模型 ,3 0d后用Morris水迷宫检测两组大鼠空间记忆能力及免疫组织化学染色检测海马CA1区胆碱能神经元数目的变化。结果 :手术组大鼠空间记忆能力明显下降 ,海马CA1区胆碱能数目较对照组明显减少。结论 :血管性痴呆大鼠海马胆碱能神经元减少 ,空间记忆能力下降。

短暂性缺氧后海马神经元神经源性分化因子表达增高

目的观察短暂性缺氧后神经源性分化因子(NeuroD)表达量的变化,探讨其在神经系统再生中的可能作用。方法体外培养海马神经元,经神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组织化学方法、尼氏体染色法鉴定。将培养5d的神经元置于三气培养箱(37℃、94%N2、5%CO2、1%O2)内缺氧培养。RT-PCR检测缺氧3h和6h后神经元NeuroD mRNA表达水平,电镜观察神经元形态学变化。将缺氧3h的神经元置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养96h,固定前48h加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)(终浓度为10μmol/L),免疫组织化学检测有无细胞增殖。结果 RT-PCR显示,缺氧3h后NeuroD表达量明显增高(P<0.01),而缺氧6h后NeuroD表达量与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。电镜结果显示,缺氧3h后细胞内细胞器未见明显变化,缺氧6h后细胞内出现空泡样变化,线粒体肿胀明显。免疫组织化学检测到BrdU阳性细胞。结论短暂性缺氧后NeuroD表达量增高,可能参与了神经系统的再生过程。

短暂性缺氧对鼠脑神经源性分化因子表达的影响

目的观察短暂性缺氧后鼠脑神经源性分化因子(NeuroD)表达量的变化,初步探讨其在神经系统再生中的可能作用。方法"延迟剖宫产术"建立胎鼠宫内窘迫模型,通过RT-PCR检测窘迫不同时间后NeuroD mRNA表达量的变化,通过免疫荧光对NeuroD蛋白的表达进行定性分析。结果宫内窘迫5min,NeuroD mRNA表达量未见明显变化(P>0.05),窘迫10、15、20min后其表达量随窘迫时间的延长而不断增高。免疫荧光示在尾壳核区域NeuroD表达量明显增加。结论短暂性缺氧后NeuroD表达量增高,可能参与了神经系统的再生过程。

电针刺激促进神经干细胞的增殖和分化

神经系统疾病致不可逆神经元死亡一直是医学难题,如何改善患者的神经功能,为该领域的攻克重点。近年来研究表明,神经系统并非不可再生,具有分裂分化潜能的内源性神经干细胞(eNSC)大量存在于成年中枢神经系统(CNS)中,平时处于静止状态,在病理状态下如缺氧、损伤时,eNSC可能被激活,进一步增殖和分化,参与神经系统的修复。传统医学中国针灸在治疗神经系统疾病尤其是神经系统的损伤上有着独特的优势,其治疗机制在分子生物学研究上尚不清楚,是否能够促进eNSC的增殖和分化,尚需进一步的研究。

IL-10对大鼠脑缺血损伤保护作用的研究

目的探讨IL-10对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用。方法采用改良ZeaLonga线栓法制作大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,在缺血不同时间(0.5和3h),应用不同剂量重组IL-10(0.5和1μg)行侧脑室注射,观察脑梗死体积以及缺血区神经元和中性粒细胞浸润的变化情况。结果无论在0.5或3hIL-10注射组脑梗死体积以及坏死神经元的数量与生理盐水对照组比较均明显减小(P<0.05),且0.5h组较3h组更明显(P<0.05),IL-101μg组比0.5μg组减少更明显(P<0.05)。而中性粒细胞的浸润0.5hIL-10注射组与生理盐水对照组相比较明显减少(P<0.05),且IL-101μg组与0.5μg组相比较减少更显著(P<0.05)。而3h中性粒细胞的浸润IL-10注射组与生理盐水对照组相比较没有明显的变化(P>0.05)。结论IL-10对脑缺血损伤有保护作用,其保护作用可能是通过减少缺血后局部中性粒细胞的浸润,减少神经元凋亡而实现的。

局灶性脑缺血大鼠白细胞介素10的变化

探讨脑缺血后不同时间血清和局部脑缺血组织白细胞介素10的变化。采用改良zea Longa线栓法制作大鼠大脑中动脉闭塞模型,在缺血不同时间,应用双抗体夹心间接酶联免疫吸附法检测缺血组和假手术对照组大鼠受损脑组织及血清中白细胞介素10的浓度。结果发现,缺血组脑组织白细胞介素10含量在大脑中动脉闭塞3h处于较低水平,与假手术对照组比较无明显变化(P>0.05);6 h达最低,与假手术对照组比较变化显著(P<0.01),随后逐渐升高(P<0.05);血清中白细胞介素10含量在3 h最低,与假手术对照组比较变化显著(P<0.05),随后逐渐升高(P<0.05)。结果提示,白细胞介素10对脑缺血损伤可能有保护作用。

骨桥蛋白RNA干扰对人U251胶质瘤细胞在裸鼠体内生长的影响

研究下调骨桥蛋白(osteopontin,OPN)对人U251胶质瘤细胞在裸鼠体内生长的影响并探讨其对胶质瘤生长、侵袭的可能机制.应用RNA干扰技术,将OPN基因的慢病毒干扰载体LV-OPNshRNA感染U251细胞.将对照和试验组U251细胞分别接种裸鼠,建立裸鼠荷瘤模型.3周后测量肿瘤的体积、瘤重并做肿瘤组织病理切片分析;利用RT-PCR和免疫印迹法检测OPN、尿激酶型纤维蛋白酶原激活物(uPA)、基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)的mRNA和蛋白表达;免疫组化法检测肿瘤组织微血管密度和血管内皮生长因子(VEGF)表达情况.经OPN的RNA干扰后,能显著降低肿瘤组织OPN mRNA水平及蛋白表达,有效抑制肿瘤细胞生长及侵袭能力,肿瘤体积及重量的减小有统计学意义(P<0.05).感染组uPA、MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白表达明显减少,肿瘤组织的MVD值和VEGF的表达均显著降低.上述结果表明,抑制OPN的表达能明显抑制人U251胶质瘤细胞在裸鼠体内的生长和侵袭,OPN可能通过激活uPA、MMP-2和MMP-9等蛋白酶降解细胞外基质和促进肿瘤血管生成,参与胶质瘤的生长.

反复熔铸对非贵金属烤瓷合金弯曲性能的影响

目的:探讨反复熔铸对非贵金属烤瓷合金弯曲性能的影响。方法:弯曲试件由非贵金属烤瓷合金分别经过1次、2次、3次、4次以及5次熔铸后,再经万能工具磨床研磨而成。根据ISO7438标准,对所有试件进行三点弯曲加载直至试件断裂,测试所有非贵金属烤瓷合金试件的弯曲强度及弯曲模量。结果:经过不同铸造次数的非贵金属烤瓷合金,在弯曲强度和弯曲模量上有显著差异(P<0.05)。经过2次、4次铸造的合金与经过1次铸造的合金之间的弯曲强度无显著差异,而经过3次、5次铸造的合金在弯曲强度上显著高于经过1次铸造的合金(P<0.05);经过2次、5次铸造的合金与经过1次铸造的合金之间的弯曲模量无显著差异,而经过3次、4次铸造的合金在弯曲模量上则显著高于经过1次铸造的合金(P<0.05)。结论:非贵金属烤瓷合金至少可以重复铸造5次而不引起弯曲性能的下降。

Ang-1基因修饰的骨髓间质干细胞移植治疗脑梗死的实验研究

目的:观察血管生成素-1(Ang-1)和骨髓间质干细胞(MSCs)对脑梗死的联合治疗作用。方法:构建带有大鼠Ang-1基因的慢病毒载体,感染大鼠骨髓间质干细胞(rMSCs)获得可表达具有生物活性Ang-1蛋白的rMSCs(Ang-rMSCs)。制备大鼠大脑中动脉栓塞模型,随机分为对照组、Ang-rMSCs组及空载体-rMSCs(pNL-rMSCs)组。脑栓塞术后24h进行细胞移植。各组大鼠分别于术后24h、移植后1周、1月及3月用mNSS量表评价神经功能状况,移植后1周应用伊文思蓝(EB)检测血脑屏障通透性,应用荧光激发及荧光免疫组化观察移植细胞在脑内的存活、分化情况,并经组织学观察有无成瘤迹象。结果:与对照组相比,移植后1周、1月,pNL-rMSCs及Ang-rMSCs组神经功能改善明显(P<0.01),Ang-rMSCs组明显优于pNL-rMSCs组(P<0.001)。移植后3月3组间的mNSS评分差异无显著(P>0.05)。EB检测示血脑屏障通透性在pNL-rMSCs及Ang-rMSCs组低于对照组(P<0.01),Ang-rMSCs组低于pNL-rMSCs组(P<0.01)。移植后1周、1月及3月,Ang-rMSCs和pNL-rMSCs组在荧光激发下均见移植细胞在梗死灶及其周边区聚集并存活。荧光免疫组化检测示Ang-rMSCs组中移植细胞大量表达Ang-1,两移植组中均有部分细胞可同时表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)或星形胶质细胞标志物神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。未观察到移植细胞异常增殖等成瘤迹象。结论:Ang-1基因修饰的rMSCs移植后可迁移至脑梗死灶周围,分化表达神经细胞标志物并较长期存活。MSCs移植与其分泌的Ang-1蛋白可协同促进脑梗死后神经功能恢复。

小RNA干扰骨桥蛋白抑制人U251细胞的体外生长与侵袭

目的：研究慢病毒载体介导的骨桥蛋白（OPN） RNA干扰对人U251神经胶质瘤细胞体外生长和侵袭的影响,并探讨其对神经胶质瘤生长、侵袭的可能机制.方法：应用本实验室已构建并鉴定的OPN特异性短发卡RNA慢病毒表达载体（LV-OPN shRNA）感染U251神经胶质瘤细胞.RT-PCR检测干扰前、后U251细胞OPN mRNA的表达;免疫印迹法检测干扰前、后U251细胞OPN、MMP-2、MMP-9、uPA蛋白表达;MTT法检测细胞增殖能力的变化;Transwell体外侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化;细胞划痕实验观察细胞迁移能力的变化.结果：与未感染组、空载体感染组相比,LV-OPN shRNA感染组OPN mRNA、OPN蛋白及MMP-2、MMP-9、uPA蛋白表达均明显下降;LV-OPN shRNA感染组细胞增殖、侵袭能力及迁移能力也明显下降.结论：慢病毒载体介导的骨桥蛋白RNA干扰在体外能抑制U251细胞OPN mRNA和蛋白表达, 进而抑制U251细胞在体外的生长及侵袭,因此可以推测OPN是促进胶质瘤增殖和侵袭的基因之一,为胶质瘤的治疗提供新的靶点.

经静脉移植骨髓间质干细胞治疗脑梗死

目的观察经静脉移植骨髓间质干细胞(MSC)治疗脑梗死时神经功能缺损的恢复情况,以及MSC在脑梗死灶的分布、迁移与分化情况。方法经尾静脉将标记的大鼠骨髓间质干细胞(rMSC)或磷酸缓冲液(PBS)植入脑梗死鼠体内,于不同时程对动物神经功能状况进行评分。应用荧光标记及免疫组织化学方法检测移植细胞在脑内存活、迁移及分化情况,细胞化学染色观察rMSC体外分化情况。结果与PBS组相比,rMSC组大鼠神经功能改善明显(P<0.001),在显微镜下可见脑移植细胞在梗死区及其周边区聚集并存活,有部分植入细胞分化表达神经细胞表面标志物,而在体外同时程培养的rMSC未见类似分化表达。结论rMSC经静脉移植后能够在宿主脑内存活、迁移并分化表达神经细胞表型,有促进脑梗死后神经功能恢复的作用。经静脉路移植可以避免脑组织损伤,同时植入的rMSC能更均匀分布并聚集在脑梗死灶。

IL-10对脓毒症大鼠心肌损伤保护作用的实验研究

目的探讨IL-10对脓毒症大鼠心肌损伤保护作用及其机制。方法48只SD大鼠随机分为假手术组(sham组)、模型对照组(CLP组)和IL-10干预组各16只。采用盲肠结扎穿刺法(CLP)造模。IL-10干预组于造模成功后0.5 h经尾静脉注入重组人IL-101μg,术后12、24 h用ELISA法检测血浆中TNF-α、IL-1及cTnI的含量,术后24 h取大鼠心肌组织,用Tunel法检测心肌细胞凋亡。结果脓毒症大鼠血浆中TNF-α、IL-1及cTnI表达明显增多,并于12 h达高峰;IL-10干预组术后12、24 h血浆中TNF-α、IL-1及cTnI表达较CLP组明显降低(P<0.01)。IL-10干预组术后24 h心肌细胞凋亡明显高于sham组,但低于CLP组(P<0.05)。结论脓毒症可诱导大鼠TNF-α、IL-1的表达,导致其心肌损伤的发生,cTnI表达的上调,使大鼠心肌细胞的凋亡增加;IL-10可通过下调脓毒症大鼠TNF-α、IL-1表达,减轻炎症反应,减少心肌细胞损伤及凋亡,从而保护心肌组织。

反复铸造对镍铬烤瓷合金金瓷结合力的影响

背景:目前国内外学者对如何回收再利用烤瓷合金废旧料及是否添加新合金问题上存在争议。其中镍铬烤瓷合金在真空加氩气保护的环境下反复铸造后金瓷结合力的变化报道较少。目的:观察反复铸造对镍铬烤瓷合金金瓷结合力的影响。设计、时间及地点:观察实验,于2008-06/08分别在福建医科大学附属口腔医院技工室、武汉大学口腔医学院口腔生物医学工程教育部重点实验室、福建医科大学神经生物研究中心完成。材料:镍铬烤瓷合金为UNIMETALVH,SHOFUCo.,Japan产品,烤瓷粉为VINTAGE,SHOFUCo.,Japan.产品。方法:根据ISO9693标准,用三点弯曲试验测试在氩气保护真空加压铸造环境下分别经过1～5次铸造后的镍铬烤瓷合金的金瓷结合力,并采用单因素方差分析对其进行统计分析。观察试件被加载至瓷层完全剥脱后,试件金属基底表面形貌及脱落瓷的形态。主要观察指标:试件加载后金瓷开裂瞬间的力值,瓷层剥脱后的金属表面形貌及瓷层剥脱后的瓷表面形貌。结果:分别经过1～5次铸造后的镍铬烤瓷合金的金瓷结合力之间差异无显著性意义(P=0.164)。体式显微镜下可见剥脱的瓷层完整无破裂,试件金属基底瓷层剥脱面呈毛玻璃样。结论:镍铬烤瓷合金在真空加氩气保护铸造条件下分别经过1～5次铸造后,金瓷结合力无显著性下降。

6-羟基多巴胺诱导的帕金森病大鼠眼内褪黑素受体的变化

目的:观察6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的偏侧帕金森病(PD)模型大鼠毁损同侧及对侧眼褪黑素受体MT1和MT2的变化及其与视网膜酪氨酸羟化酶(TH)的关系。方法:将6-OHDA注射至大鼠右侧黑质致密部和前脑内侧束两点,制备偏侧PD模型。大鼠分为溶剂对照和PD模型组,于建模后6周取双侧眼球。采用RTPCR和Western-Blot检测大鼠两侧眼组织褪黑素受体MT1和MT2的表达水平,采用免疫荧光组织化学检测MT1和MT2受体,以及TH在大鼠视网膜内的分布及表达情况。结果:与对照相比,PD大鼠毁损对侧眼组织MT1和MT2的mRNA水平分别降低了84.06%和81.66%(P<0.01),蛋白水平分别降低了59.06%和41.06%(P<0.01),而PD大鼠毁损同侧眼组织MT1和MT2的mRNA、蛋白水平无显著变化(P>0.05)。MT1和MT2受体在视网膜全层均有分布,且主要分布在感光细胞层内段、内丛状层、外丛状层和神经节细胞层,TH分布于内核层与内丛状层之间;与对照组相比,PD大鼠毁损对侧视网膜MT1和MT2以及TH荧光强度分别减少了61.6%、51.2%和43.0%(P<0.01),TH和MT1或TH和MT2存在共定位,且毁损对侧视网膜共定位细胞数减少52.3%,而PD大鼠毁损同侧视网膜无显著变化(P>0.05)。结论:6-OHDA诱导的偏侧PD大鼠毁损对侧眼褪黑素受体表达下调可能与PD有关。

成年大鼠脑透析液和血清中褪黑素含量的测定

目的：采用高效液相色谱（HPLC）‐荧光法和酶联免疫（ELISA）法测定成年大鼠脑微透析液及血清中的褪黑素（MLT）含量，比较2种检测方法的灵敏性、准确性及可靠性。方法将微透析引导管置入正常成年大鼠纹状体内1周后，采用脑微透析技术动态收集2：00，6：00，10：00，14：00，18：00和22：00的透析液，并于次日22：00行尾静脉取血；用 HPLC‐荧光法和ELISA法分别测定透析液及血清样本中的MLT水平。结果 HPLC‐荧光法测定MLT检出限为0．1 pg／mL ，在1．0～500 pg／mL之间呈线性关系，回归方程 y＝10446 x＋8603．5（r＝0．9987，P＜ 0．001），日间、日内精密度均＜6％；ELISA 法检出限为5．92 pg／mL ，检测线性范围为12．35～1000 pg／mL。用HPLC‐荧光法测定2：00，6：00，10：00，14：00，18：00和22：00大鼠脑透析液中的MLT含量分别为（32．99 ± 2．22），（18．25 ± 2．27），（4．03 ± 1．70），（2．92 ± 1．08），（12．08 ± 1．77）和（21．83 ± 2．04）pg／m L ，具有明显的昼夜节律性，探针回收率为12％～13％；22：00血清中的MLT含量为（82．62 ± 8．09）pg／mL ，提取回收率＞90％，且血清与透析液中的MLT水平呈高度正相关（r＝0．987，P＜0．001）；用ELISA法测定血清中的MLT含量为（81．31±9．62）pg／mL ，且用2种方法测定血清中MLT差别无统计学意义（P＝0．115）。结论用HPLC‐荧光法测定大鼠脑微透析液和血清中的MLT 含量具有灵敏、快速、准确、重复性好等特点，且 HPLC‐荧光法和ELISA法测定血清中的MLT具有较好的一致性。

大鼠骨髓间质干细胞和新鲜骨髓细胞静脉移植治疗脑梗死的疗效

目的比较大鼠骨髓间质干细胞(rMSC)和新鲜骨髓细胞(fBMC)静脉移植后在脑梗死时脑内存活、迁移及分化情况,及对神经功能恢复的影响。方法制备大鼠脑梗死模型,经尾静脉将标记的rMSC和fBMC植入体内,于不同时程对神经功能状况进行评分。应用荧光激发及免疫组织化学方法检测移植细胞在脑内存活、迁移及分化情况。细胞化学染色观察rMSC体外分化情况。结果与对照组比较,两移植组神经功能改善明显(P<0.001),组间mNSS评分比较无统计学意义(P>0.05)。两移植组在荧光激发下均可见移植细胞在梗死区及其周边区聚集并存活,且有部分植入细胞分化表达神经细胞表面标志物,在体外rMSC未见类似分化表达。两组植入细胞存活与分化标志表达率差别无统计学意义。结论rMSC和fBMC经静脉移植后在宿主脑内均能够存活、迁移并分化表达神经细胞表型,均有促进脑梗死后神经功能恢复的作用。

不同病程帕金森病大鼠纹状体多巴胺转运蛋白的动态变化

目的：观察不同病程帕金森病（PD）大鼠纹状体多巴胺转运蛋白（DAT）的动态变化，并探讨该变化与黑质酪氨酸羟化酶（TH）之间的关系。方法：采用双点注射6-OHDA至大鼠右侧黑质致密部和前脑内侧束，建立偏侧PD模型。建模后2周、4周、6周的PD大鼠分别尾静脉注射99mTc-TRODAT-1，1h后取左右纹状体，以1计数仪测定放射性计数，并计算单位质量的左、右放射性计数率以及左、右纹状体单位质量的放射性计数比值。同时取建模后2周、4周、6周PD大鼠黑质组织进行TH免疫染色，观察阳性细胞形态及分布。结果：PD大鼠毁损侧纹状体放射计数明显低于健侧，建模后2周、4周、6周PD大鼠DAT相对放射计数较健侧分别降低了16．8％、35．9％和50．1％（P〈0．05～0．001）；不同病程PD大鼠毁损侧纹状体DAT的相对放射计数与TH阳性细胞数呈高度的正相关（P〈0．01，R=0．9，n=15）。结论：PD大鼠纹状体DAT含量随着病程的增加逐渐减少，“Tc—PRO-DAT-1的放射性分布能够较准确的反映突触前多巴胺能神经元的变化。