构建创新型神经生物学实验教学体系的思路与实践

以加强对学生创新意识和创新能力的培养为核心,调整原有开设的实验项目,增加综合性设计性神经生物学实验,优化实验内容、实验方法和实验手段,改革考核制度、评价体系和实验管理制度,建立一种开放式、学生主动参与的教学模式,建立一支具有较高理论综合知识、较好科研素质和较高实验教学水平的新型教师队伍。构建神经生物学实验教学新体系,旨在提高学生综合素质,培养具有创新意识、创新精神和创新能力的高质量人才;在改革实践同时树立创新教学理念,进一步推动教学实践。

缺氧对小胶质细胞N9生物学功能的影响

目的:通过观察缺氧环境中小胶质细胞N9生物学功能的变化,进一步探讨活化态小胶质细胞在缺血缺氧性脑病中的作用机制。方法:通过建立N9细胞缺氧培养系,观察细胞形态学及其生长增殖活力的改变。利用RT-PCR、还原WST-1法及荧光探针DAF-FMDA法检测胞内TNF-α、iNOS、O2-等因子的表达水平;通过JC-1荧光和ELISA检测细胞线粒体膜电位和胞质及线粒体内细胞色素C的含量。结果:在缺氧早期,N9细胞增殖随缺氧时间延长而下降;细胞的形态在缺氧12h时变化最典型。在缺氧早期N9细胞内O2-、TNF-α含量以及iNOS相对活性等多种神经毒性因子的表达水平增加。缺氧可导致N9细胞线粒体结构与功能改变,线粒体膜电位呈时间依赖性下降;线粒体细胞色素C的含量随缺氧时间延长而增加。结论:缺氧可诱导N9细胞生物学功能改变,呈现应激活化状态,主要表现在细胞生长增殖活力先上调后下降,神经毒性因子表达水平显著增高,细胞线粒体功能改变等方面。

雷公藤提取物在神经免疫性疾病中的药理效应和机制研究进展

雷公藤提取物具有显著的抗炎和免疫抑制活性,临床上被广泛用于类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的治疗,在抗肿瘤和抗器官移植排斥方面也有很强的作用。随着免疫炎症机制在阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化等神经变性疾病中的研究进展,抗炎和免疫调节也成为延缓这些疾病病程的重要策略。新近研究发现,雷公藤提取物能促进神经元的存活和轴突伸展,促使受损的脑功能恢复,从而延缓多种神经变性疾病的病理生理进展。药理研究表明,雷公藤提取物的药理效应与其抑制过度活化的胶质细胞产生的神经炎性毒性、抗氧化、调节神经钙通道、调节T细胞功能及其神经营养作用有关。分子水平的研究显示,对NF-κB信号的抑制是雷公藤提取物主要的靶点。因而,雷公藤提取物在神经免疫炎症性疾病中具有很好的开发价值和临床应用前景。

血管性痴呆大鼠行为学及海马胆碱能神经元的变化

目的 :研究血管性痴呆大鼠海马胆碱能神经元及行为的变化。方法 :将大鼠随机分成手术组及对照组 ,手术组制作血管性痴呆大鼠模型 ,3 0d后用Morris水迷宫检测两组大鼠空间记忆能力及免疫组织化学染色检测海马CA1区胆碱能神经元数目的变化。结果 :手术组大鼠空间记忆能力明显下降 ,海马CA1区胆碱能数目较对照组明显减少。结论 :血管性痴呆大鼠海马胆碱能神经元减少 ,空间记忆能力下降。

大鼠胚胎中脑腹侧细胞和大脑皮质神经干细胞移植治疗帕金森病大鼠的比较

体外培养的大鼠胚胎中脑腹侧(VM)细胞和大脑皮质神经干细胞(NSCs)分别移植入帕金森病(PD)模型大鼠毁损侧纹状体。移植后2,4,8周采用脑微透析术结合高效液相色谱(HPLC)动态监测毁损侧纹状体内多巴胺水平,同期观察大鼠的旋转行为。移植后8周采用免疫组化法检测植入细胞的存活及分化情况。结果显示:移植后4,8周VM移植组多巴胺水平明显高于NSCs移植组或对照组,同期VM移植组较其余两组旋转行为有显著改善,而NSCs移植组与对照组多巴胺水平及旋转行为无显著差异。VM移植组较NSCs移植组植入的细胞易存活和分化。以上结果提示,大鼠胚胎VM细胞移植治疗PD模型的疗效明显优于胚胎大脑皮质NSCs。

视神经再生模型的超微结构

目的 观察正常大鼠视神经及坐骨神经的超微结构 ,了解视神经 -坐骨神经吻合模型吻合段超微结构在不同时间的变化。 方法 建立视神经 -坐骨神经吻合模型 ,第 15 ,30 ,4 5及 6 0天取出吻合段神经组织 ,透射电镜观察。 结果 正常大鼠坐骨神经纤维较视神经纤维明显增粗 ,吻合 15 d,神经细胞明显变性、水肿及坏死 ,吻合30 ,4 5及 6 0 d,有髓神经纤维的结构逐渐恢复。

大鼠大脑皮质神经元的原代培养

目的探讨大鼠大脑皮质神经元的培养方法。方法体外原代培养新生大鼠大脑皮质神经元,应用免疫细胞化学法及电子显微镜鉴定神经元。结果用神经基础培养基(Neurobasal-A)+B27培养的神经元纯度可达85%,生长状态较佳。结论以Neurobasal-A+B27培养的大鼠大脑皮质神经元活性较佳,纯度较高,是体外研究神经系统相关理论的良好模型。

酸枣仁皂甙A对急性高眼压大鼠视网膜神经节细胞的保护作用

目的探讨酸枣仁皂甙A对实验性急性高眼压(HIOP)鼠眼视网膜神经节细胞(RGCs)的保护作用。方法36只SD大鼠随机等分为空白对照组、模型组、酸枣仁皂甙A组,除空白对照组外,各组均用生理盐水前房灌注法建立急性高眼压模型。造模成功后酸枣仁皂甙A组给予酸枣仁皂甙A20mg/kg鼠尾静脉注射,每天1次,共7d。模型组予相同体积的生理盐水代替。术后7d,取大鼠眼球通过免疫组化检测和RT-PCR检测THY-1蛋白及mRNA表达。结果(1)空白对照组和对照组视网膜节细胞层的节细胞差异有统计学意义(P<0.01);空白对照组和酸枣仁皂甙A组之间差异没有统计学意义。空白对照组、模型组和酸枣仁皂甙A组的视网膜神经节细胞密度分别为(22.0±2.2)个/高倍镜、(16±2.8)个/高倍镜和(21±2.7)个/高倍镜。(2)RT-PCR检测THY-1mRNA的表达在造模7d后明显降低,与正常组的差异有统计学意义(P<0.01);酸枣仁皂甙A组跟正常组THY-1mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论酸枣仁皂甙A可提高实验性急性高眼压鼠眼RGCs的存活率,对RGCs具有保护作用。

短暂性缺氧对鼠脑神经源性分化因子表达的影响

目的观察短暂性缺氧后鼠脑神经源性分化因子(NeuroD)表达量的变化,初步探讨其在神经系统再生中的可能作用。方法"延迟剖宫产术"建立胎鼠宫内窘迫模型,通过RT-PCR检测窘迫不同时间后NeuroD mRNA表达量的变化,通过免疫荧光对NeuroD蛋白的表达进行定性分析。结果宫内窘迫5min,NeuroD mRNA表达量未见明显变化(P>0.05),窘迫10、15、20min后其表达量随窘迫时间的延长而不断增高。免疫荧光示在尾壳核区域NeuroD表达量明显增加。结论短暂性缺氧后NeuroD表达量增高,可能参与了神经系统的再生过程。

神经调节素-1β对大鼠脑局灶性缺血再灌注后白质损伤的保护作用

目的:研究神经调节素-1β(NRG-1β)对大鼠脑局灶性缺血再灌注脑白质损伤的保护作用.方法:SD大鼠随机分为假手术组,缺血再灌注组即MACO/A组和NRG-1β干预组.H-E染色观察脑白质组织病理学病变;透射电镜观察少突胶质细胞和髓鞘的改变.应用酶联免疫法(ELISA)检测脑白质肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量;免疫组织化学显色检测髓鞘碱性蛋白(MBP)的表达;原位切口末端标记技术(TUNEL)标记凋亡细胞的数目.结果:与假手术组相比,缺血再灌注组缺血侧脑白质囊性变,大量炎症细胞浸润,电镜下可见脱髓鞘改变.MBP阳性分布减少,TNF-α含量增高,凋亡细胞增多与假手术组相比差异均有统计学意义.NRG-1β干预组与缺血再灌注组相比,H-E染色显示缺血侧脑白质囊性变减少,炎症细胞浸润减少,电镜下脱髓鞘改变减少.MBP阳性分布有增多,TNF-α含量减少,凋亡细胞减少差异均有统计学意义.结论:大脑中动脉缺血再灌注可对脑白质造成显著损伤.侧脑室注射NRG-1β干预治疗对脑缺血再灌注后的脑白质具有保护作用,其机制与抑制炎症反应、减少胶质细胞凋亡和髓鞘破坏相关.

视网膜神经节细胞损伤机制及神经保护药物研究进展

近年来,青光眼的研究焦点已转向神经保护。各种以不同的神经保护药物为基础的实验研究结果表明,神经保护治疗能减少视网膜神经节细胞的损害。针对引起视网膜神经节细胞死亡的不同机制及靶点已开发出多种不同来源的视网膜神经节细胞神经保护药物,这些药物通过多种分子机制及信号通路发挥作用,部分药物已进入临床研究阶段,并有望进入临床使用。

三叉神经痛大鼠三叉神经根区Fyn的表达变化

目的:在三叉神经痛(trigeminal neuralgia,TN)动物模型基础上,研究三叉神经根区(trigeminal nerve root entry zone,TREZ)Fyn蛋白的表达。方法:通过三叉神经根慢性压迫损伤诱导建立大鼠TN动物模型,von Frey丝检测大鼠口面部术前1 d和术后1、3、7、14、21 d和28 d的机械性痛敏,然后在大鼠分别存活7、14、21 d和28 d时灌注取材,采用免疫荧光染色方法以及蛋白质印迹(Western Blot)技术检测三叉神经根区Fyn的表达变化。结果:(1)行为学结果显示:TN模型组大鼠术后14 d的机械性痛敏阈值明显降低,与假手术(Sham)组相比有显著性差异(P<0.05);(2)免疫荧光染色显示:TN模型组大鼠术后三叉神经根区Fyn阳性细胞增多,Sham组未见明显变化。(3)Western Blot显示:TN模型组大鼠术后7 d Fyn表达量相对Sham组降低(P<0.05),术后14 d降至最低;术后21 d Fyn表达上调,但仍低于Sham组;术后28 d TN组Fyn表达量明显上升且高于Sham组。结论:大鼠TREZ慢性压迫损伤后,Fyn表达在TN早期降低,而在TN后期Fyn表达升高,提示Fyn可能参与TN动物模型的发病过程。

IL-10对大鼠脑缺血损伤保护作用的研究

目的探讨IL-10对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用。方法采用改良ZeaLonga线栓法制作大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,在缺血不同时间(0.5和3h),应用不同剂量重组IL-10(0.5和1μg)行侧脑室注射,观察脑梗死体积以及缺血区神经元和中性粒细胞浸润的变化情况。结果无论在0.5或3hIL-10注射组脑梗死体积以及坏死神经元的数量与生理盐水对照组比较均明显减小(P<0.05),且0.5h组较3h组更明显(P<0.05),IL-101μg组比0.5μg组减少更明显(P<0.05)。而中性粒细胞的浸润0.5hIL-10注射组与生理盐水对照组相比较明显减少(P<0.05),且IL-101μg组与0.5μg组相比较减少更显著(P<0.05)。而3h中性粒细胞的浸润IL-10注射组与生理盐水对照组相比较没有明显的变化(P>0.05)。结论IL-10对脑缺血损伤有保护作用,其保护作用可能是通过减少缺血后局部中性粒细胞的浸润,减少神经元凋亡而实现的。

局灶性脑缺血大鼠白细胞介素10的变化

探讨脑缺血后不同时间血清和局部脑缺血组织白细胞介素10的变化。采用改良zea Longa线栓法制作大鼠大脑中动脉闭塞模型,在缺血不同时间,应用双抗体夹心间接酶联免疫吸附法检测缺血组和假手术对照组大鼠受损脑组织及血清中白细胞介素10的浓度。结果发现,缺血组脑组织白细胞介素10含量在大脑中动脉闭塞3h处于较低水平,与假手术对照组比较无明显变化(P>0.05);6 h达最低,与假手术对照组比较变化显著(P<0.01),随后逐渐升高(P<0.05);血清中白细胞介素10含量在3 h最低,与假手术对照组比较变化显著(P<0.05),随后逐渐升高(P<0.05)。结果提示,白细胞介素10对脑缺血损伤可能有保护作用。

Ang-1基因修饰的骨髓间质干细胞移植治疗脑梗死的实验研究

目的:观察血管生成素-1(Ang-1)和骨髓间质干细胞(MSCs)对脑梗死的联合治疗作用。方法:构建带有大鼠Ang-1基因的慢病毒载体,感染大鼠骨髓间质干细胞(rMSCs)获得可表达具有生物活性Ang-1蛋白的rMSCs(Ang-rMSCs)。制备大鼠大脑中动脉栓塞模型,随机分为对照组、Ang-rMSCs组及空载体-rMSCs(pNL-rMSCs)组。脑栓塞术后24h进行细胞移植。各组大鼠分别于术后24h、移植后1周、1月及3月用mNSS量表评价神经功能状况,移植后1周应用伊文思蓝(EB)检测血脑屏障通透性,应用荧光激发及荧光免疫组化观察移植细胞在脑内的存活、分化情况,并经组织学观察有无成瘤迹象。结果:与对照组相比,移植后1周、1月,pNL-rMSCs及Ang-rMSCs组神经功能改善明显(P<0.01),Ang-rMSCs组明显优于pNL-rMSCs组(P<0.001)。移植后3月3组间的mNSS评分差异无显著(P>0.05)。EB检测示血脑屏障通透性在pNL-rMSCs及Ang-rMSCs组低于对照组(P<0.01),Ang-rMSCs组低于pNL-rMSCs组(P<0.01)。移植后1周、1月及3月,Ang-rMSCs和pNL-rMSCs组在荧光激发下均见移植细胞在梗死灶及其周边区聚集并存活。荧光免疫组化检测示Ang-rMSCs组中移植细胞大量表达Ang-1,两移植组中均有部分细胞可同时表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)或星形胶质细胞标志物神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。未观察到移植细胞异常增殖等成瘤迹象。结论:Ang-1基因修饰的rMSCs移植后可迁移至脑梗死灶周围,分化表达神经细胞标志物并较长期存活。MSCs移植与其分泌的Ang-1蛋白可协同促进脑梗死后神经功能恢复。

巴戟天根两种提取物对微波损伤大鼠生精功能的影响

目的:探讨巴戟天根不同浓度提取物对微波损伤的雄性SD大鼠生精功能的影响。方法:40只健康雄性SD大鼠先分为正常对照组和辐射组,辐射后再将辐射组分为辐射模型组,巴戟天根水提物治疗组和巴戟天根醇提物治疗组,每组10只。辐射组应用微波信号发生器(900 HZ 1.0 W),功率密度为218μm/cm2,12 h/d,持续辐射2周。治疗组在辐射后分别给予巴戟天根水提物和巴戟天根醇提物20 g/(kg.d)持续灌胃2周。观察各组大鼠生长发育,扑捉潜伏期(CIP)和扑捉次数(CT),睾丸和附睾指数及精子形态学的差异,精子浓度、精子畸形率以及血清睾酮的浓度。结果:与正常对照组[(269.50±36.07)g]相比,辐射模型组[(254.77±20.38)g]大鼠体重稍降低,CIP延长及CT减少(P<0.05),精子浓度[(87.717±12.365)×106/ml]降低及精子畸形率[(0.126±0.100)×106/ml]明显升高(P<0.05);睾丸和附睾出现不同程度的病理损伤改变,睾丸指数降低,血清睾酮水平无明显变化。两治疗组较正常对照组体重显著下降(P<0.05),血清睾酮的水平显著升高,且与辐射模型组相比CT增加、CIP缩短、精子浓度显著升高、畸形率显著下降、血清睾酮的水平升高(P<0.05)。治疗组睾丸的病理性损伤显著修复,附睾管内除见大量精子外,还可见大量脱落的细胞。结论:巴戟天根的水提取物和醇提取物均可促进微波辐射损伤的生殖器官的修复以及精子的生成。

慢病毒介导新型Tet-On系统调控大鼠GDNF和TH双基因表达对帕金森病大鼠的实验研究

目的观察改良Tet-On系统修饰慢病毒(Lv-TH-GDNF)目的基因的表达调控及纹状体内直接转移对帕金森病(PD)大鼠的作用。方法 1用Lv-TH-GDNF与rt TA2s-M2病毒感染He La细胞,免疫印迹法检测强力霉素(Dox)对TH、GDNF基因表达的调控。2用Lv-TH-GDNF与rt TA2sM2病毒共同注射到PD大鼠患侧纹状体,Dox诱导目的基因表达。通过观察阿扑吗啡(APO)诱导旋转行为、黑质多巴胺能神经元数量、患侧纹状体DA、DOPAC含量评估Lv-THGDNF治疗效应;通过移植侧纹状体内TH与GDNF蛋白量评估外源基因在体内的表达。结果 1在体外He La细胞实验,仅Dox阳性组见TH、GDNF蛋白条带。2在动物体内实验,病毒移植4周后,与PBS对照组相比,仅病毒+Dox组大鼠旋转行为明显改善(P<0.01),损伤侧黑质致密部TH阳性细胞数、纹状体DA、DOPAC含量及TH和GDNF蛋白量明显增高(P<0.01)。结论新型Tet-On系统修饰的Lv-THGDNF目的基因表达受四环素类抗生素调控,在体外实验未见基础活动,且纹状体内直接转移对PD大鼠有一定治疗作用。

5-HT_2受体-磷脂酶C的激活易化大鼠基底外侧杏仁核突触可塑性的研究

为了探讨5-HT2受体激动剂盐酸2,5-二甲氧基-4-碘苯基丙烷(DOI)对杏仁核突触可塑性的调节作用,本研究在杏仁核脑片上记录基底外侧杏仁核(BLA)场电位,应用单串的θ频率波刺激(TBS)诱导突触可塑性,观察DOI对TBS诱导的突触可塑性的影响,及5-HT2受体拮抗剂、磷脂酶C抑制剂能否抑制DOI的作用。结果显示:单串的TBS刺激外囊,在BLA仅诱导约为10min的短时程增强。灌流液中加入100μmol/L DOI 20min,对基础的场电位没有作用。但在DOI存在的情况下,单串的TBS即可诱导长时程增强,强直刺激30min后,增强的场电位斜率仍维持在基础值的(162.5±9.7)%(n=9,P<0.01)。DOI对TBS诱导的突触可塑性的易化作用可被5-HT2A/2C受体拮抗剂ketanserin和PLC抑制剂U73122所抑制。以上结果提示5-HT2A/2C受体的激活可通过磷脂酶C通路易化杏仁核的突触可塑性。