构建创新型神经生物学实验教学体系的思路与实践

以加强对学生创新意识和创新能力的培养为核心,调整原有开设的实验项目,增加综合性设计性神经生物学实验,优化实验内容、实验方法和实验手段,改革考核制度、评价体系和实验管理制度,建立一种开放式、学生主动参与的教学模式,建立一支具有较高理论综合知识、较好科研素质和较高实验教学水平的新型教师队伍。构建神经生物学实验教学新体系,旨在提高学生综合素质,培养具有创新意识、创新精神和创新能力的高质量人才;在改革实践同时树立创新教学理念,进一步推动教学实践。

视网膜神经节细胞损伤机制及神经保护药物研究进展

近年来,青光眼的研究焦点已转向神经保护。各种以不同的神经保护药物为基础的实验研究结果表明,神经保护治疗能减少视网膜神经节细胞的损害。针对引起视网膜神经节细胞死亡的不同机制及靶点已开发出多种不同来源的视网膜神经节细胞神经保护药物,这些药物通过多种分子机制及信号通路发挥作用,部分药物已进入临床研究阶段,并有望进入临床使用。

大鼠胚胎中脑腹侧细胞和大脑皮质神经干细胞移植治疗帕金森病大鼠的比较

体外培养的大鼠胚胎中脑腹侧(VM)细胞和大脑皮质神经干细胞(NSCs)分别移植入帕金森病(PD)模型大鼠毁损侧纹状体。移植后2,4,8周采用脑微透析术结合高效液相色谱(HPLC)动态监测毁损侧纹状体内多巴胺水平,同期观察大鼠的旋转行为。移植后8周采用免疫组化法检测植入细胞的存活及分化情况。结果显示:移植后4,8周VM移植组多巴胺水平明显高于NSCs移植组或对照组,同期VM移植组较其余两组旋转行为有显著改善,而NSCs移植组与对照组多巴胺水平及旋转行为无显著差异。VM移植组较NSCs移植组植入的细胞易存活和分化。以上结果提示,大鼠胚胎VM细胞移植治疗PD模型的疗效明显优于胚胎大脑皮质NSCs。

慢病毒介导新型Tet-On系统调控大鼠GDNF和TH双基因表达对帕金森病大鼠的实验研究

目的观察改良Tet-On系统修饰慢病毒(Lv-TH-GDNF)目的基因的表达调控及纹状体内直接转移对帕金森病(PD)大鼠的作用。方法 1用Lv-TH-GDNF与rt TA2s-M2病毒感染He La细胞,免疫印迹法检测强力霉素(Dox)对TH、GDNF基因表达的调控。2用Lv-TH-GDNF与rt TA2sM2病毒共同注射到PD大鼠患侧纹状体,Dox诱导目的基因表达。通过观察阿扑吗啡(APO)诱导旋转行为、黑质多巴胺能神经元数量、患侧纹状体DA、DOPAC含量评估Lv-THGDNF治疗效应;通过移植侧纹状体内TH与GDNF蛋白量评估外源基因在体内的表达。结果 1在体外He La细胞实验,仅Dox阳性组见TH、GDNF蛋白条带。2在动物体内实验,病毒移植4周后,与PBS对照组相比,仅病毒+Dox组大鼠旋转行为明显改善(P<0.01),损伤侧黑质致密部TH阳性细胞数、纹状体DA、DOPAC含量及TH和GDNF蛋白量明显增高(P<0.01)。结论新型Tet-On系统修饰的Lv-THGDNF目的基因表达受四环素类抗生素调控,在体外实验未见基础活动,且纹状体内直接转移对PD大鼠有一定治疗作用。

5-HT_2受体-磷脂酶C的激活易化大鼠基底外侧杏仁核突触可塑性的研究

为了探讨5-HT2受体激动剂盐酸2,5-二甲氧基-4-碘苯基丙烷(DOI)对杏仁核突触可塑性的调节作用,本研究在杏仁核脑片上记录基底外侧杏仁核(BLA)场电位,应用单串的θ频率波刺激(TBS)诱导突触可塑性,观察DOI对TBS诱导的突触可塑性的影响,及5-HT2受体拮抗剂、磷脂酶C抑制剂能否抑制DOI的作用。结果显示:单串的TBS刺激外囊,在BLA仅诱导约为10min的短时程增强。灌流液中加入100μmol/L DOI 20min,对基础的场电位没有作用。但在DOI存在的情况下,单串的TBS即可诱导长时程增强,强直刺激30min后,增强的场电位斜率仍维持在基础值的(162.5±9.7)%(n=9,P<0.01)。DOI对TBS诱导的突触可塑性的易化作用可被5-HT2A/2C受体拮抗剂ketanserin和PLC抑制剂U73122所抑制。以上结果提示5-HT2A/2C受体的激活可通过磷脂酶C通路易化杏仁核的突触可塑性。

视神经再生模型的超微结构

目的 观察正常大鼠视神经及坐骨神经的超微结构 ,了解视神经 -坐骨神经吻合模型吻合段超微结构在不同时间的变化。 方法 建立视神经 -坐骨神经吻合模型 ,第 15 ,30 ,4 5及 6 0天取出吻合段神经组织 ,透射电镜观察。 结果 正常大鼠坐骨神经纤维较视神经纤维明显增粗 ,吻合 15 d,神经细胞明显变性、水肿及坏死 ,吻合30 ,4 5及 6 0 d,有髓神经纤维的结构逐渐恢复。

大鼠大脑皮质神经元的原代培养

目的探讨大鼠大脑皮质神经元的培养方法。方法体外原代培养新生大鼠大脑皮质神经元,应用免疫细胞化学法及电子显微镜鉴定神经元。结果用神经基础培养基(Neurobasal-A)+B27培养的神经元纯度可达85%,生长状态较佳。结论以Neurobasal-A+B27培养的大鼠大脑皮质神经元活性较佳,纯度较高,是体外研究神经系统相关理论的良好模型。

酸枣仁皂甙A对急性高眼压大鼠视网膜神经节细胞的保护作用

目的探讨酸枣仁皂甙A对实验性急性高眼压(HIOP)鼠眼视网膜神经节细胞(RGCs)的保护作用。方法36只SD大鼠随机等分为空白对照组、模型组、酸枣仁皂甙A组,除空白对照组外,各组均用生理盐水前房灌注法建立急性高眼压模型。造模成功后酸枣仁皂甙A组给予酸枣仁皂甙A20mg/kg鼠尾静脉注射,每天1次,共7d。模型组予相同体积的生理盐水代替。术后7d,取大鼠眼球通过免疫组化检测和RT-PCR检测THY-1蛋白及mRNA表达。结果(1)空白对照组和对照组视网膜节细胞层的节细胞差异有统计学意义(P<0.01);空白对照组和酸枣仁皂甙A组之间差异没有统计学意义。空白对照组、模型组和酸枣仁皂甙A组的视网膜神经节细胞密度分别为(22.0±2.2)个/高倍镜、(16±2.8)个/高倍镜和(21±2.7)个/高倍镜。(2)RT-PCR检测THY-1mRNA的表达在造模7d后明显降低,与正常组的差异有统计学意义(P<0.01);酸枣仁皂甙A组跟正常组THY-1mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论酸枣仁皂甙A可提高实验性急性高眼压鼠眼RGCs的存活率,对RGCs具有保护作用。

缺氧对小胶质细胞N9生物学功能的影响

目的:通过观察缺氧环境中小胶质细胞N9生物学功能的变化,进一步探讨活化态小胶质细胞在缺血缺氧性脑病中的作用机制。方法:通过建立N9细胞缺氧培养系,观察细胞形态学及其生长增殖活力的改变。利用RT-PCR、还原WST-1法及荧光探针DAF-FMDA法检测胞内TNF-α、iNOS、O2-等因子的表达水平;通过JC-1荧光和ELISA检测细胞线粒体膜电位和胞质及线粒体内细胞色素C的含量。结果:在缺氧早期,N9细胞增殖随缺氧时间延长而下降;细胞的形态在缺氧12h时变化最典型。在缺氧早期N9细胞内O2-、TNF-α含量以及iNOS相对活性等多种神经毒性因子的表达水平增加。缺氧可导致N9细胞线粒体结构与功能改变,线粒体膜电位呈时间依赖性下降;线粒体细胞色素C的含量随缺氧时间延长而增加。结论:缺氧可诱导N9细胞生物学功能改变,呈现应激活化状态,主要表现在细胞生长增殖活力先上调后下降,神经毒性因子表达水平显著增高,细胞线粒体功能改变等方面。

神经调节素-1β对大鼠脑局灶性缺血再灌注后白质损伤的保护作用

目的:研究神经调节素-1β(NRG-1β)对大鼠脑局灶性缺血再灌注脑白质损伤的保护作用.方法:SD大鼠随机分为假手术组,缺血再灌注组即MACO/A组和NRG-1β干预组.H-E染色观察脑白质组织病理学病变;透射电镜观察少突胶质细胞和髓鞘的改变.应用酶联免疫法(ELISA)检测脑白质肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量;免疫组织化学显色检测髓鞘碱性蛋白(MBP)的表达;原位切口末端标记技术(TUNEL)标记凋亡细胞的数目.结果:与假手术组相比,缺血再灌注组缺血侧脑白质囊性变,大量炎症细胞浸润,电镜下可见脱髓鞘改变.MBP阳性分布减少,TNF-α含量增高,凋亡细胞增多与假手术组相比差异均有统计学意义.NRG-1β干预组与缺血再灌注组相比,H-E染色显示缺血侧脑白质囊性变减少,炎症细胞浸润减少,电镜下脱髓鞘改变减少.MBP阳性分布有增多,TNF-α含量减少,凋亡细胞减少差异均有统计学意义.结论:大脑中动脉缺血再灌注可对脑白质造成显著损伤.侧脑室注射NRG-1β干预治疗对脑缺血再灌注后的脑白质具有保护作用,其机制与抑制炎症反应、减少胶质细胞凋亡和髓鞘破坏相关.

三叉神经痛大鼠三叉神经根区Fyn的表达变化

目的:在三叉神经痛(trigeminal neuralgia,TN)动物模型基础上,研究三叉神经根区(trigeminal nerve root entry zone,TREZ)Fyn蛋白的表达。方法:通过三叉神经根慢性压迫损伤诱导建立大鼠TN动物模型,von Frey丝检测大鼠口面部术前1 d和术后1、3、7、14、21 d和28 d的机械性痛敏,然后在大鼠分别存活7、14、21 d和28 d时灌注取材,采用免疫荧光染色方法以及蛋白质印迹(Western Blot)技术检测三叉神经根区Fyn的表达变化。结果:(1)行为学结果显示:TN模型组大鼠术后14 d的机械性痛敏阈值明显降低,与假手术(Sham)组相比有显著性差异(P<0.05);(2)免疫荧光染色显示:TN模型组大鼠术后三叉神经根区Fyn阳性细胞增多,Sham组未见明显变化。(3)Western Blot显示:TN模型组大鼠术后7 d Fyn表达量相对Sham组降低(P<0.05),术后14 d降至最低;术后21 d Fyn表达上调,但仍低于Sham组;术后28 d TN组Fyn表达量明显上升且高于Sham组。结论:大鼠TREZ慢性压迫损伤后,Fyn表达在TN早期降低,而在TN后期Fyn表达升高,提示Fyn可能参与TN动物模型的发病过程。

自噬在阿尔茨海默病发病机制中的研究进展

自噬是一种溶酶体依赖性的降解途径,主要负责真核细胞内细胞器和长寿命蛋白质的降解,在维持细胞稳态中发挥着重要的作用。自噬在阿尔茨海默病(AD)发病机制中起重要作用。研究发现,自噬与β-淀粉样蛋白沉积、轴突运输功能障碍以及tau蛋白磷酸化等神经病理改变相互作用,并且早老素参与了自噬-溶酶体系统功能的维持。

反复熔铸对非贵金属烤瓷合金弯曲性能的影响

目的:探讨反复熔铸对非贵金属烤瓷合金弯曲性能的影响。方法:弯曲试件由非贵金属烤瓷合金分别经过1次、2次、3次、4次以及5次熔铸后,再经万能工具磨床研磨而成。根据ISO7438标准,对所有试件进行三点弯曲加载直至试件断裂,测试所有非贵金属烤瓷合金试件的弯曲强度及弯曲模量。结果:经过不同铸造次数的非贵金属烤瓷合金,在弯曲强度和弯曲模量上有显著差异(P<0.05)。经过2次、4次铸造的合金与经过1次铸造的合金之间的弯曲强度无显著差异,而经过3次、5次铸造的合金在弯曲强度上显著高于经过1次铸造的合金(P<0.05);经过2次、5次铸造的合金与经过1次铸造的合金之间的弯曲模量无显著差异,而经过3次、4次铸造的合金在弯曲模量上则显著高于经过1次铸造的合金(P<0.05)。结论:非贵金属烤瓷合金至少可以重复铸造5次而不引起弯曲性能的下降。

巴戟天根两种提取物对微波损伤大鼠生精功能的影响

目的:探讨巴戟天根不同浓度提取物对微波损伤的雄性SD大鼠生精功能的影响。方法:40只健康雄性SD大鼠先分为正常对照组和辐射组,辐射后再将辐射组分为辐射模型组,巴戟天根水提物治疗组和巴戟天根醇提物治疗组,每组10只。辐射组应用微波信号发生器(900 HZ 1.0 W),功率密度为218μm/cm2,12 h/d,持续辐射2周。治疗组在辐射后分别给予巴戟天根水提物和巴戟天根醇提物20 g/(kg.d)持续灌胃2周。观察各组大鼠生长发育,扑捉潜伏期(CIP)和扑捉次数(CT),睾丸和附睾指数及精子形态学的差异,精子浓度、精子畸形率以及血清睾酮的浓度。结果:与正常对照组[(269.50±36.07)g]相比,辐射模型组[(254.77±20.38)g]大鼠体重稍降低,CIP延长及CT减少(P<0.05),精子浓度[(87.717±12.365)×106/ml]降低及精子畸形率[(0.126±0.100)×106/ml]明显升高(P<0.05);睾丸和附睾出现不同程度的病理损伤改变,睾丸指数降低,血清睾酮水平无明显变化。两治疗组较正常对照组体重显著下降(P<0.05),血清睾酮的水平显著升高,且与辐射模型组相比CT增加、CIP缩短、精子浓度显著升高、畸形率显著下降、血清睾酮的水平升高(P<0.05)。治疗组睾丸的病理性损伤显著修复,附睾管内除见大量精子外,还可见大量脱落的细胞。结论:巴戟天根的水提取物和醇提取物均可促进微波辐射损伤的生殖器官的修复以及精子的生成。

早期干预与TrkA受体在脑损伤修复中的作用

目的:研究早期干预对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)大鼠脑功能的影响及其与神经生长因子TrkA受体表达的关系。方法:将HIBD大鼠分为干预(H1)组和非干预(H0)组,用跳台试验检测各组大鼠学习记忆能力,并用酶免疫组织化学技术检测TrkA受体的表达情况。结果:H0组错误反应潜伏期较正常对照组明显缩短,而H1组的学习记忆能力则明显提高。同时,H1组额皮质和海马CA3区TrkA受体阳性神经元数目明显多于H0组。结论:早期干预方法可提高HIBD大鼠学习记忆能力,其促进脑功能修复的机制与提高脑神经细胞TrkA受体表达有关。

以差速贴壁与化学药物并胰酶限时消化法纯化新生大鼠嗅鞘细胞:优于单一差速贴壁和化学药物法吗?

背景:目前国内外对嗅鞘细胞培养条件的报道各不相同,个别方法重复性较差,不利于实际应用。目的:观察差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化法纯化大鼠嗅鞘细胞的效果,并与化学药物法、差速贴壁法培养结果进行比较。设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-06/2008-06在福建医科大学人体解剖与组织胚胎学系实验室完成。材料:新生2d的SD大鼠8只,由福建医科大学试验动物中心提供。方法:无菌条件下完整取出大鼠双侧嗅球,剥除嗅球表面的软脑膜及毛细血管网,剪成0.5mm3的小块进行胰蛋白酶消化,过筛后按4.0×108L-1密度种植于包被多聚左旋赖氨酸的培养瓶中进行原代培养。设立4组:①未经纯化的常规对照组。②化学药物组加入5μmol/L阿糖胞苷抑制成纤维细胞分裂。③差速贴壁组采用Nash差速贴壁法纯化嗅鞘细胞。④差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化组首先采用Nash差速贴壁法去除大部分成纤维细胞,而后对于少量残留的成纤维细胞加入阿糖胞苷处理,培养6d贴壁细胞大部分融合后,加入1.25g/L胰蛋白酶消化1min,显微镜下见突起回缩、细胞变圆、少量细胞浮起时终止消化。主要观察指标:嗅鞘细胞的形态,NGFRp75免疫细胞荧光染色结果。结果:体外培养的新生大鼠嗅球嗅鞘细胞主要为双极或三极细胞,其突起细长;未经纯化的常规对照组培养7d时视野内成纤维细胞已达60%以上,至14d成纤维细胞完全长满;经过纯化处理的另外3组始终以嗅鞘细胞居多,嗅鞘细胞的形态与原代基本相同。存活的双极和3极嗅鞘细胞呈NGFRp75阳性反应,但化学药物组、差速贴壁组嗅鞘细胞纯度偏低,仅为75%;差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化组嗅鞘细胞纯化效率明显增高,达85%以上。结论:实验结果证实了差速贴壁+化学药物+胰酶限时消化法的三合一操作技术,是一种高效率的纯化培养嗅球嗅鞘细胞的方法。

反复铸造对镍铬烤瓷合金金瓷结合力的影响

背景:目前国内外学者对如何回收再利用烤瓷合金废旧料及是否添加新合金问题上存在争议。其中镍铬烤瓷合金在真空加氩气保护的环境下反复铸造后金瓷结合力的变化报道较少。目的:观察反复铸造对镍铬烤瓷合金金瓷结合力的影响。设计、时间及地点:观察实验,于2008-06/08分别在福建医科大学附属口腔医院技工室、武汉大学口腔医学院口腔生物医学工程教育部重点实验室、福建医科大学神经生物研究中心完成。材料:镍铬烤瓷合金为UNIMETALVH,SHOFUCo.,Japan产品,烤瓷粉为VINTAGE,SHOFUCo.,Japan.产品。方法:根据ISO9693标准,用三点弯曲试验测试在氩气保护真空加压铸造环境下分别经过1～5次铸造后的镍铬烤瓷合金的金瓷结合力,并采用单因素方差分析对其进行统计分析。观察试件被加载至瓷层完全剥脱后,试件金属基底表面形貌及脱落瓷的形态。主要观察指标:试件加载后金瓷开裂瞬间的力值,瓷层剥脱后的金属表面形貌及瓷层剥脱后的瓷表面形貌。结果:分别经过1～5次铸造后的镍铬烤瓷合金的金瓷结合力之间差异无显著性意义(P=0.164)。体式显微镜下可见剥脱的瓷层完整无破裂,试件金属基底瓷层剥脱面呈毛玻璃样。结论:镍铬烤瓷合金在真空加氩气保护铸造条件下分别经过1～5次铸造后,金瓷结合力无显著性下降。

巴戟天水提液有效萃取成分促进微波致雄性大鼠生殖损伤的修复

目的探讨巴戟天(Morinda officinalis F.C.How)水提液对微波辐射致生殖系统损伤的修复作用。方法以900MHz频率、218μm/cm2辐射密度的低功率微波持续辐射10天,建立雄性SD大鼠生殖损伤模型。66只健康成年雄性SD大鼠随机分为11组。A组为空白对照组,B组为辐射未给药组,C组为辐射+生理盐水组,D组为巴戟天水提液乙酸乙酯萃取水层治疗组,E组为巴戟天水提液乙酸乙酯萃取酯层治疗组(其中D、E组各有10g、20g、30g、40g生药量/kg浓度梯度组)。每天灌胃1.5ml,持续14d。观察大鼠性行为学指标差异,同时检测血清睾酮变化;比较睾丸、附睾指数以及睾丸组织形态学的改变。结果巴戟天水提液乙酸乙酯萃取各层浓度梯度组分别给药后,D3、D4组扑捉潜伏期与B、C组相比缩短,D4组扑捉次数较之B、C组增加,余治疗组性行为学指标与B、C组无明显差别。D3、D4组睾酮水平较之B、C组均显著升高。HE染色和PCNA/SCP3双重免疫荧光染色显示,随着给药剂量增大,D组大鼠生精细胞数量逐渐增多,以A型精原细胞和粗线期初级精母细胞修复最为明显。结论巴戟天水提液乙酸乙酯萃取水层可改善大鼠性欲、修复生精上皮生精细胞和精子生成,最佳治疗剂量为40g/kg,其机制可能与促进睾酮分泌增加有关。

牛垂体提取物、碱性成纤维细胞生长因子及Forskolin影响嗅鞘细胞增殖的量效关系

背景:生长因子参与调节嗅鞘细胞增殖、分化及代谢功能,因此有望通过应用其合理的序贯刺激形式,达到细胞数量地大量扩增。目的:观察牛垂体提取物、碱性成纤维细胞生长因子及Forskolin对嗅鞘细胞增殖的影响及剂量-效应关系。方法:采用原代培养技术,从新生大鼠的嗅球分离培养嗅鞘细胞,并用差速贴壁+化学药物+胰酶快速消化法纯化培养嗅鞘细胞,添加牛垂体提取物、碱性成纤维细胞生长因子及Forskolin 3种促增殖因子及其组合。MTT法检测各组嗅鞘细胞生长的情况。根据NGFRp75抗体的免疫细胞化学染色统计嗅鞘细胞的纯度和计算嗅鞘细胞的增殖率。结果与结论:在嗅鞘细胞原代培养和纯化后,添加牛垂体提取物具有促进嗅鞘细胞增殖的效应,但未见典型的剂量-效应关系;添加碱性成纤维细胞生长因子具有促进嗅鞘细胞增殖的效应,且呈现典型的剂量-效应关系;添加Forskolin并不具有促进嗅鞘细胞增殖的效应。说明合理应用不同质量浓度的碱性成纤维细胞生长因子与Forskolin进行联合刺激,能有效促进细胞的增殖。结果表明序贯的使用合适浓度的生长因子组合,将是有效促进嗅鞘细胞增殖的合理策略,有助于解决脊髓损伤治疗中种子细胞来源不足这一问题。