抗EGFR/CD3双特异性抗体的制备与功能的初步研究

目的构建抗表皮生长因子受体(anti-EGFR)和抗CD3(anti-CD3)的双特异性抗体(anti-EGFR/CD3),并在体外初步评价其杀伤肿瘤的功能。方法通过基因工程技术,利用knobs-into-holes模式分别构建表达anti-EGFR-HC-knob、anti-EGFR-LC和anti-CD3-scFV-HC-hole的载体,共同转染Expi 293F细胞,表达双特异性抗体,依次用抗体特异的亲和层析和分子排阻层析进行纯化,再用流式细胞仪和实时无标记细胞功能分析仪评价其体外结合能力和体外肿瘤杀伤功能。结果成功获得较高纯度的抗体。流式细胞仪体外结合实验结果显示,双特异性抗体能够同时与EGFR+的U87Ⅷ脑胶质瘤细胞系、HCT-116结肠癌细胞系和CD3+的Jurkat T淋巴瘤细胞系结合,具有2种抗体的功能,同时还能很好地激活T细胞(P<0.000 1);在体外杀伤效果方面,双特异性抗体作用后杀伤效果明显高于其他抗体和对照组(均为P<0.000 1),具有很好的杀伤效果。结论用knobs-intoholes技术获得的anti-EGFR/CD3具有较好的生物活性,为双特异性抗体的肿瘤免疫治疗奠定了一定的基础。

FMU100抗体的超高效液相色谱法定量检测方法的建立

目的建立UPLC-protein A定量检测FMU100单克隆抗体的方法。方法使用Waters UPLC超高效液相色谱仪,Applied Biosystem的PA ImmunoDetection Sensor Cartridge(2.1×30mm,20μm)色谱柱,柱温30℃,检测波长280nm,进样体积10μL,以流动相A(10mmol/L PBS含0.15mmol/L NaCl,pH 7.2)-流动相B(0.15mmol/L NaCl,pH 2.6)进行梯度洗脱,流速0.5mL/min。结果在0.034~2.200mg/mL浓度,线性相关系数r^2为0.999 9,浓度与峰面积间呈良好的线性关系;检测限为0.01mg/mL,定量限为0.07mg/mL;回收率为98.18%~99.16%;重复性RSD为0.1%~1.9%;在8h内,每个2h测定发酵液中抗体的含量,FMU100抗体峰面积RSD为1.8%;在流动相A pH变化±0.2、流动相B NaCl比例变化±5%、柱温变化±5℃、检测波长变化±5nm、流速相对值变化±20%时,FMU100抗体峰峰面积RSD为1.7%(n=12);检测方法符合系统适应性要求。结论建立的UPLC-protein A定量检测FMU100抗体的方法简单快速、方法可靠,符合方法学验证要求。