雷公藤提取物在神经免疫性疾病中的药理效应和机制研究进展

雷公藤提取物具有显著的抗炎和免疫抑制活性,临床上被广泛用于类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的治疗,在抗肿瘤和抗器官移植排斥方面也有很强的作用。随着免疫炎症机制在阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化等神经变性疾病中的研究进展,抗炎和免疫调节也成为延缓这些疾病病程的重要策略。新近研究发现,雷公藤提取物能促进神经元的存活和轴突伸展,促使受损的脑功能恢复,从而延缓多种神经变性疾病的病理生理进展。药理研究表明,雷公藤提取物的药理效应与其抑制过度活化的胶质细胞产生的神经炎性毒性、抗氧化、调节神经钙通道、调节T细胞功能及其神经营养作用有关。分子水平的研究显示,对NF-κB信号的抑制是雷公藤提取物主要的靶点。因而,雷公藤提取物在神经免疫炎症性疾病中具有很好的开发价值和临床应用前景。

寡聚态β-淀粉样肽_(1～42)可通过胶质-炎症反应损伤神经元

目的观察寡聚态β-淀粉样肽1～42(Oligo-Aβ1～42)诱导的小胶质细胞条件培养液对Neuro-2A神经元细胞的影响,探讨炎症介质在胶质介导的神经元损伤中的作用。方法以Oligo-Aβ1～42诱导BV-2细胞,制备小胶质细胞条件培养液,四甲基偶氮唑蓝法(MTT)测定Neuro-2A神经细胞的活力,AO-EB染色荧光显微镜观察计数细胞凋亡和坏死率;酶联免疫吸附试验(ELISA法)测定小胶质细胞培养上清中的肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)及前列腺素E2(PGE2)水平;Griess法检测上清NO水平;免疫印迹法测定小胶质细胞胞质环氧合酶2(COX-2)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达水平。结果Oligo-Aβ1～42诱导的小胶质细胞条件培养液(Aβ-CM)明显引起Neuro-2A神经细胞损伤,MTT法显示神经元活力随Aβ诱导剂量的增加而逐渐下降(P<0.01),并且浓度为1.0μmol/L和5.0μmol/L的Aβ-CM组比同浓度Aβ单纯组神经细胞的存活率更低,分别为(53.75±3.95)和(34.61±2.72)(Aβ-CM组与Aβ单纯组相比P<0.05,P<0.01);联合作用组(Aβ-CM+Aβ)神经细胞存活率下降更明显,两因素方差分析显示,Aβ诱导的小胶质细胞条件培养液与单纯Aβ(1.0μmol/L)有协同作用[F(3,39)=53.16,P<0.001]。AO-EB荧光观察计数显示,低浓度(0.2μmol/L)Oligo-Aβ1～42诱导的小胶质细胞条件培养液可引起神经细胞发生凋亡性损伤,较高浓度(1.0～5.0μmol/L)Oligo-Aβ1～42诱导不仅引起神经细胞凋亡,还引起细胞发生坏死性改变。进一步研究显示,低浓度(0.2～5.0μmol/L)的Oligo-Aβ1～42明显增加小胶质细胞培养上清中TNF-α、PGE2、NO的产量及胞质COX-2和iNOS蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01),呈现一定的量效关系。结论低浓度Oligo-Aβ1～42可通过胶质-炎症反应加剧神经元损伤,其作用可能与Oligo-Aβ1～42诱导小胶质细胞产生炎症介质及胞质内COX-2、iNOS蛋白表达水平增高有关。

视觉系统异常作为阿尔茨海默病临床生物标志物的探索和研究应用前景

视觉系统异常是视觉通路受损导致的症状前期或临床期出现视力、视野、视觉感知障碍等一系列症候群。视觉系统异常并非阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的典型临床症候。但最近的研究证据表明,视觉系统异常的出现可能早于AD的认知损害,同时预示其可能增加AD发生的风险。迄今为止,视觉系统异常随年龄变化与AD进展之间的关系尚不明确。探索老年人群视觉通路改变与AD的相关性、针对以视觉通路缺陷为特征的生物标志物的早期发现,以期预警早期AD认知损害并及时干预,将有望实现AD个体化全病程管理,改善AD患者的生活质量。本文就视觉系统异常在AD全病程中的临床、病理特征及其研究应用前景和研究方向进行综述。

自噬在阿尔茨海默病发病机制中的研究进展

自噬是一种溶酶体依赖性的降解途径,主要负责真核细胞内细胞器和长寿命蛋白质的降解,在维持细胞稳态中发挥着重要的作用。自噬在阿尔茨海默病(AD)发病机制中起重要作用。研究发现,自噬与β-淀粉样蛋白沉积、轴突运输功能障碍以及tau蛋白磷酸化等神经病理改变相互作用,并且早老素参与了自噬-溶酶体系统功能的维持。

赤芍801通过抗氧化作用减轻脑缺血/再灌注损伤

目的探讨在缺血后给予赤芍801对脑缺血/再灌注损伤的保护作用及可能的抗氧化作用。方法大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤后,通过NSS和运动功能评分观察赤芍801对大鼠神经功能的影响。分别通过TTC染色、Nissl染色和TUNEL染色观察再灌注后脑梗死体积、缺血周边区神经元的存活和凋亡情况。检测缺血周边区MDA和SOD指标,探讨赤芍801发挥神经保护的可能机制。结果缺氧后给予94μmol·kg-1·d-1赤芍801能很好的改善大鼠的NSS和运动功能评分,减少缺血周边区TUNEL阳性细胞数,增加Nissl染色阳性细胞数,并减少MDA的生成、提高SOD的含量。结论赤芍801能通过抗氧化作用,保护脑缺血周边区的神经元,从而提高脑缺血/再灌注大鼠远期的神经功能恢复。

甲基强的松龙通过下调ERK1/2-NF-κB信号通路减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠脊髓炎症

目的观察甲基强的松龙(MP)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠神经功能的影响,探讨其抑制脊髓炎症的可能机制。方法采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55多肽(MOG35-55)诱导雌性C57BL/6小鼠,建立EAE小鼠模型。待小鼠发病后,连续腹腔注射PBS或者MP,作为溶媒组和MP组。另取同龄正常小鼠,腹腔注射PBS,作为对照组。通过H-E染色观察炎症细胞的浸润情况,罗克沙尔坚牢蓝(LFB)染色及电镜观察髓鞘脱失,实时荧光定量PCR检测炎症因子mRNA水平及T细胞特异性转录因子(T-bet)、维甲酸A相关孤儿素受体(RORγt)mRNA水平,免疫印迹检测T-bet、RORγt、细胞外信号调节酶(ERK1/2)和核转录因子NF-κB蛋白变化。结果与溶媒组比较,MP组小鼠炎症细胞浸润、髓鞘破坏明显减少(P<0.05);脊髓细胞因子IFN-γ,IL-17,IL-21及IL-23mRNA表达降低,而IL-4,IL-5及IL-10mRNA表达升高;Th1/Th17特异性谱系转录因子T-bet和RORγt mRNA及蛋白表达减少;ERK1/2及NF-κB蛋白磷酸化降低。结论 MP可能通过抑制ERK1/2-NF-κB信号通路改善EAE的神经功能评分,减轻脊髓炎性细胞浸润及髓鞘脱失,提示ERK1/2-NF-κB信号通路可能是MP发挥抗炎作用的主要靶点之一。

妊娠期脂多糖接触激活体内TLR4信号通路引起胚胎脑内炎症应激

目的:观察孕鼠腹腔脂多糖(LPS)注射后母体外周血单个核细胞(PBMNC)上Toll样受体4(TLR4)信号通路激活情况和胚胎脑组织中炎症性细胞因子的水平。方法:10.5 d孕鼠腹腔注射LPS 0、3、6、12、24、48和72 h后,通过蛋白免印迹测定孕鼠PBMNC上TLR4、分化抗原14(CD14)、髓样分化蛋白2(MD-2)、p65和p50蛋白水平,Luminex 100免疫荧光法测定孕鼠血清、羊水、脑组织及胚胎脑组织细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-10蛋白水平,实时RT-PCR测定孕鼠PBMNC和胚胎脑组织TNF-α、IL-1β和IL-10 mRNA水平。结果:LPS腹腔注射诱导激活孕鼠PBMNC上TLR4信号通路,TLR4、CD14和MD-2蛋白水平短暂增高,核因子κB(NF-κB)激活片段p65和p50蛋白水平增高,TNF-α、IL-1β和IL-10 mRNA水平增高(P<0.01);孕鼠外周血和羊水TNF-α、IL-1β和IL-10水平短暂增高(P<0.01),脑内IL-1β蛋白水平短暂升高(P<0.01);胚胎脑内TNF-α和IL-1β蛋白和mRNA水平显著增高(P<0.01)。结论:妊娠期母体LPS接触可激活母体外周免疫细胞TLR4信号通路,引发胚胎脑内炎症应激状态,可能增加出生后相关疾病的发生风险。

组蛋白去乙酰化酶6在阿尔茨海默病中的作用

组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)是HDAC家族中Ⅱb类成员之一,具有去乙酰化酶活性和参与细胞内异常蛋白降解的功能。近来研究发现HDAC6参与调节Tau蛋白磷酸化、糖原合成酶激酶3β(GSK3β)影响线粒体运输等有关的生化过程,提示HDAC6可能与AD的发生有关,是治疗AD的潜在靶点。本文论述了HDAC6的结构与功能、HDAC6的选择性抑制剂以及在AD中的作用。

非酶糖化、晚期糖基化终产物与阿尔茨海默病

许多证据显示非酶糖化及其晚期产物-晚期糖基化终产物(AGEs)在阿尔茨海默病(AD)发病中的重要作用。AGEs促进蛋白交联;糖化β-淀粉样蛋白与AGEs受体相互作用激活小胶质和星形胶质细胞,促进氧化应激、分泌诱导型一氧化氮合酶和前炎症细胞因子,并损伤神经元,促进AD的发生发展。AGEs及其受体在AD中的可能作用机制为开发预防、治疗AD的新药提供理论基础。

寡聚态β淀粉样蛋白加剧小胶质细胞衰老

目的观察小胶质细胞体内外自发衰老现象,探讨β淀粉样蛋白对小胶质细胞体外衰老影响。方法Iba-1免疫组织化学法观察年轻和老年小鼠大脑皮质小胶质细胞形态学变化,通过衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-GAL)染色法观察小胶质细胞衰老现象;原代培养纯化小胶质细胞,观察体外不同培养时间小胶质细胞自发衰老指标SA-β-GAL染色变化。用不同浓度寡聚态Aβ(oligomeric Aβ,oAβ)诱导处理小胶质细胞不同时间后,检测小胶质细胞SA-β-GAL表达,通过γH2AX免疫细胞化学染色检测DNA损伤标记物表达变化。结果在体老年鼠可出现小胶质细胞衰老表型;一定时间范围内小胶质细胞体外培养越长,SA-β-GAL染色阳性率越高(P<0.001),显示增龄性衰老变化。与对照组相比,oAβ处理组小胶质细胞SA-β-GAL染色阳性率增加(P<0.05)。同时,处理组小胶质细胞γH2AX表达明显上调(P<0.05)。结论小胶质细胞体内体外存在自发衰老现象,oAβ诱导并加剧小胶质细胞衰老可能与增加DNA损伤有关。

钙蛋白酶-细胞周期依赖性蛋白激酶5通路参与β淀粉样蛋白25-35诱导的tau蛋白过度磷酸化

目的探讨凝聚态β淀粉样蛋白25-35片段(Aβ25-35)对胎鼠皮质神经元中性钙蛋白酶-细胞周期依赖性蛋白激酶5(calpain-CDK5)通路的影响及其对tau蛋白的过度磷酸化和骨架稳定性的影响。方法用荧光酶标仪测定荧光强度来反映calpain活性;用Western-blot和(或)免疫细胞化学检测CDK5的激活蛋白p25/p35的蛋白水平和tau蛋白Thr205/Ser404位点磷酸化情况来体现CDK5活性;用电镜技术观察微管结构的变化来显示细胞骨架的改变情况。结果20μmol/L的凝聚态Aβ25-35作用于皮质神经元12 h后,检测反映calpain活性的荧光强度(每微克蛋白荧光强度)高达680.25±37.77,与空白对照组167.25±11.67相比,差异有统计学意义(P<0.05);对CDK5有活化作用的p25蛋白水平比空白对照组升高(2.07±0.20)倍,差异也有统计学意义(P<0.05);CDK5的作用底物tau蛋白Thr205和Ser404位点磷酸化程度也显著增加,分别比空白对照组升高(1.80±0.27)和(1.83±0.14)倍,差异均有统计学意义(P<0.05);同时出现神经元微管骨架排列紊乱。结论凝聚态Aβ25-35通过活化皮质神经元的calpain,使p35降解p25来激活CDK5,促使tau蛋白过度磷酸化,破坏了微管骨架的稳定性。

大鼠大脑中动脉闭塞模型稳定性的控制及其效果评价

目的寻找制作高稳定性大鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型和无创性评价模型效果的方法。方法采用6种不同直径的栓线制作大鼠MCAO模型并比较其成功率、蛛网膜下腔出血发生率以及梗死体积，在术后和再灌注24h进行模型评分以评价模型的效果。结果在使用直径为0．28mm和头端直径为0．32～0．34mm的栓线时，模型成功率较高，蛛网膜下腔出血发生率较低，再灌注后24h进行模型评分的敏感性和特异性较高。结论使用直径为0．28mm和头端直径为0．32～0．34min的栓线能提高模型的稳定性，在再灌注后24h进行模型评分能无创性计价模型效果。

我国阿尔茨海默病诊断实施中相关问题的思考

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种与年龄相关的，以慢性、进行性加重的认知功能障碍为主要临床表现的中枢神经系统变性疾病，严重危害着中老年人的身心健康。通常该病病程较长（3～20年），给社会、家庭和患者带来沉重的负担。目前，欧洲、日本和美国65岁以上的老年人口中有5％-25％患有痴呆。我国老龄人口居世界之首，痴呆患者约500万例，按中国1999年人口年龄构成标化，55岁以上人群中，AD约有310万例，血管性痴呆（VD）约140万例。

人参皂苷Rg1对寡聚肽淀粉样β蛋白抑制蛋白激酶A通路的影响

目的 探讨蛋白激酶A信号通路在寡聚肽淀粉样p蛋白（Oligo Aβ1-42）毒性作用下的改变和人参皂苷Rg1对该通路改变的影响. 方法 运用Oligo Aβ1-42来诱导皮层神经元的损伤,实验分为空白对照组、谷氨酸处理组、Aβ组、人参皂苷Rg1与Aβ共同作用组,采用蛋白免疫印迹（Western blot）方法测定磷酸化CAMP反应元件结合蛋白（p-CREB）、总CREB蛋白（t-CREB）、蛋白激酸A（PKA）Ⅱα和脑源性神经营养因子（BDNF）的蛋白水平. 结果 Oligo Aβ1-42作用2h可降低谷氨酸诱导的p CREE/t-CREB的水平（P＜0.001）;与Aβ处理组比较,不同浓度（2.5,5,10μmol/L）预先孵育的g1组p-CREB/t-CREB的升高（P＜0.05）;与空白对照组相比,Aβ组中PKAⅡα水平升高（P＜0.001）;与Aβ组比较,不同浓度的Rg1可降低PKAⅡα水平（P＜0.001）;与Aβ组比较,不同浓度的Rg1组中BDNF水平升高（P＜0.05）. 结论 寡聚肽Aβ1-42对神经元PKA/CREB信号通路有抑制作用;人参皂苷Rg1可减轻寡聚肽Aβ1-42对PKA/CREB的抑制作用.