巢式MSP法检测恶性血液病细胞株p16基因启动子甲基化状态的研究

本研究应用改进的甲基化特异性PCR(MSP)法,即巢式甲基化特异性PCR法检测6种肿瘤细胞株p16基因启动子的甲基化状态效率,探讨其在筛选p16基因启动子高甲基化的肿瘤细胞株,及将其作为研究基因甲基化与表达关系的理想细胞模型中的应用。6种肿瘤细胞株基因组DNA经碱变性后以亚硫酸盐修饰,再用巢式甲基化特异性聚合酶链反应扩增,分析检测其p16启动子区CpG岛的甲基化状态。结果表明:CA46、U266都有不同程度的p16基因启动子区甲基化,而Molt4、K562、HL-60、Jurkat的p16基因启动子区均未甲基化。结论:用巢式甲基化特异性PCR可以准确的检测出恶性血液病细胞株p16基因的甲基化状态,方法简单,灵敏且重复性强,可以广泛用于筛选各种p16基因启动子区甲基化的恶性血液病细胞株以及恶性血液病诊断。

核糖体失活蛋白抗血液病肿瘤的研究

核糖体失活蛋白是广泛存在于高等植物中能抑制核糖体翻译功能的一类毒蛋白。它能够对哺乳动物核糖体大亚基上的28SrRNA进行脱嘌呤作用,从而破坏核糖体的结构,抑制蛋白质的生物合成。本文就核糖体失活蛋白的生物学活性以及近年来在抗血液病肿瘤方面的研究进展做一综述。

白皮杉醇扼制急性髓系白血病细胞恶性生物学特性的机制研究

目的:探讨白皮杉醇对急性髓系白血病(AML)细胞恶性生物学特性的影响及其分子机制。方法:使用不同浓度白皮杉醇干预HL60、U937及HL60/ADR、U937/ADR细胞,CCK-8法检测细胞增殖;Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测凋亡、自噬及相关信号通路蛋白的表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测耐药株中各耐药基因的表达变化。结果:白皮杉醇可抑制HL60、U937细胞活性,并诱导其凋亡。当白皮杉醇干预AML细胞24 h后,自噬标记物LC3-II/LC3-I比值随药物浓度增加而升高(r=0.672,r=0.549),当白皮杉醇干预48 h后,可下调AML细胞中Bcl-2蛋白的表达并水解活化caspase-3,同时抑制Akt/NF-κB信号通路活化水平以诱发AML细胞程序性死亡。白皮杉醇干预AML耐药株后亦可下调MRP1的表达,能逐渐削弱白血病耐药株的化疗抗性,但对BCRP表达的影响微弱,对MDR1基本无影响。结论:白皮杉醇能抑制AML细胞的增殖活性,并诱导其发生程序性死亡,其机制可能与抑制Akt/NF-κB信号通路激活、水解活化caspase-3并下调Bcl-2蛋白表达以及使部分耐药基因表达受抑等有关。

SU11248对白血病细胞HL-60增殖及凋亡作用的实验研究

目的:探讨新型抗肿瘤药物苹果酸舒尼替尼(SU11248)对白血病细胞HL-60的生物学效应的影响及其作用机制。方法:应用MTT法检测SU11248对HL-60细胞增殖能力的影响;用AnnexinV/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡;用流式细胞技术分析细胞的DNA倍体及细胞周期变化;用凝胶电泳分析DNA片段化;以Western blot法检测2.0μg/ml SU11248作用HL-60后bcl-2、bax、caspase-3蛋白水平的变化。结果:SU11248可明显抑制HL-60细胞增殖(P<0.05),呈剂量和时间依赖性,半数抑制浓度(IC50)约为2.00μg/ml。SU11248可促进细胞凋亡,并呈剂量依赖性;能将HL-60细胞阻滞于G0/G1期,并呈时间依赖性;诱导HL-60细胞呈典型的DNA梯带;SU11248作用后bcl-2蛋白表达随时间依赖性降低,caspase-3蛋白表达升高,bax蛋白表达无明显变化。结论:SU11248能抑制HL-60细胞增殖,诱导其凋亡,调节bcl-2家族蛋白的表达,并裂解caspase-3是其可能作用机制之一。

PI_3K/Akt/mTOR通路与急性早幼粒细胞白血病关系的研究进展

PI3K/Akt/mTOR信号途径作为细胞内重要信号转导通路之一,在维持细胞增殖、存活和凋亡中发挥关键作用。当PI3K/Akt/mTOR通路分子的基因功能失常、上游调控信号异常放大时使该信号通路异常激活,细胞生存与凋亡失衡,正常细胞发生恶性转化。研究表明,PI3K/Akt/mTOR信号通路在急性早幼粒细胞白血病存在异常激活,对肿瘤细胞的生存、增殖、分化、凋亡和耐药性中起重要作用。现就近年来在PI3K/Akt/mTOR信号通路与急性早幼粒细胞白血病关系研究领域的进展予以简要综述。

福建汉族急性淋巴细胞白血病及慢性粒细胞白血病HLA-DRB1基因分析

目的探讨HLADRB1基因多态性与急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性粒细胞白血病(CML)之间的关联。方法用聚合酶链反应序列特异引物(PCRSSP)方法,对32例ALL、33例CML患者和104例健康志愿者的HLADRB1基因进行分型并分析HLADRB1基因的分布。结果与正常对照组相比,ALL患者的HLADRB106的基因频率明显增高,为15.63%,RR=3.84,χ2=8.01,P<0.001;CML患者的HLADRB109的基因频率明显增高,为24.24%,RR=3.14,χ2=7.82,P<0.01,结论HLADRB106与急性淋巴细胞白血病有关联,HLADRB109与慢性粒细胞白血病有关联。

RNAi技术逆转白血病多药耐药的研究进展

RNA干扰(RNAi)是真核生物中普遍存在的一种自然现象,利用双链RNA诱发宿主细胞同源mRNA降解,从而抑制特异目的基因的表达,不仅具有理论意义,而且具有实用价值。白血病是造血系统常见的恶性肿瘤,虽然通过联合化疗大多数患者可以获得完全缓解,但是最终不可避免的是多药耐药(MDR)导致化疗的失败。MDR已成为目前治愈白血病的最大障碍。因此,逆转MDR成为白血病治疗亟待解决的问题。本文以白血病MDR机制的阐述为线索,综述了RNAi技术逆转白血病MDR的研究进展。

巢式MS-PCR法检测恶性血液病细胞株APC基因启动子甲基化状态

本研究旨在应用巢式甲基化特异性PCR(nMS-PCR)法检测10种恶性血液系统肿瘤细胞株APC基因启动子的甲基化状态,并探究其在肿瘤发生发展中的作用,同时筛选出APC基因启动子高甲基化的肿瘤细胞株,将其作为研究基因甲基化与表达关系的细胞模型。采用nMS-PCR扩增亚硫酸盐修饰后的10种肿瘤细胞株基因组DNA,检测其APC基因启动子区CpG岛的甲基化状态。结果表明,CA46、U266、Molt4、K562、HL-60、CEM、AKR、U937、Raji细胞的APC基因启动子区均未甲基化,而Jurkat细胞的APC基因启动子区出现甲基化。结论:用nMS-PCR可以准确地检测出恶性血液病细胞株APC基因的甲基化状态,该方法操作简便,可用于检测各种肿瘤细胞基因的甲基化状态。

白血病相关新基因克隆的研究进展

白血病的发生、发展与其相关基因的结构及功能异常密切相关,克隆白血病相关新基因有助于深入阐述白血病发生、发展的分子生物学机制,为白血病的诊断和治疗奠定基础。目前克隆新基因全长的方法主要有cDNA文库筛选法、cDNA末端快速扩增法、反向PCR和锅柄PCR、基于表达序列标签的全长cDNA电子克隆,用这些方法克隆的新的白血病相关新基因有ZFP91、HV126、白血病复发相关候选基因、急性白血病预后风险因子1、混合性白血病融合基因。

Smac与恶性血液病

Smac是一种存在于线粒体中，并具有调节细胞凋亡功能的蛋白质。Smac可释放入胞质，参与广泛的生物学效应。研究发现，Smac与恶性血液肿瘤的发生、发展、预后及化疗的耐受有关。了解Smac的生物学功能及其与恶性血液肿瘤的关系，选择性地调控其生物学活性，可能为恶性血液肿瘤的治疗提供一个新的途径。

靶向CXC趋化因子受体1/2联合Ara-C对急性髓系白血病U937细胞恶性生物学行为的影响与调控机制

目的:探讨CXC趋化因子受体1/2(CXCR1/2)靶向抑制剂Reparixin联合Ara-C对急性髓系白血病(AML)细胞恶性生物学行为的作用及对CXCR家族表达的影响,并探究其间存在的分子机制,为AML新型分子标记物和靶向治疗提供科学依据与参考。方法:不同浓度Reparixin、Ara-C单药或联合干预AML U937细胞,倒置显微镜下观察细胞形态;Wright-Giemsa法检测细胞形态学改变;CCK-8法检测细胞增殖;Transwell小室法检测细胞侵袭能力;集落形成实验检测细胞克隆形成能力;Hoechst 33258法、Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡;单丹黄酰尸胺(MDC)荧光示踪染色法检测细胞自噬;Western blot检测凋亡、自噬及相关信号通路蛋白的表达情况;实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测CXCR家族的表达变化。结果:Reparixin可抑制U937细胞增殖、侵袭、迁移及克隆形成能力并促发其凋亡。与单药组相比,Reparixin联合Ara-C干预U937细胞时,增殖、侵袭、集落形成等恶性生物学行为能力显著下降,凋亡和自噬水平显著升高(P<0.01)。Reparixin联合Ara-C干预U937细胞后,可上调促凋亡蛋白Bax表达并显著下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,同时亦使Caspase-3水解活化,继而诱发细胞凋亡。Reparixin联合Ara-C干预U937细胞后可上调LC3Ⅱ、Beclin-1蛋白的表达,且细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值较单药或对照组明显上调(P<0.01),MDC荧光示踪法亦示细胞中酸性囊泡绿色颗粒显著增多,且出现大量破碎细胞(P<0.01)。Reparixin联合Ara-C可显著抑制PI3K、AKT及NF-кB信号分子的磷酸化水平,通过抑制PI3K/AKT/NF-кB通路激活从而扼制白血病细胞恶性生物学行为,并诱导细胞发生程序性死亡。Ara-C干预U937细胞对CXCR家族受体表达基本无影响(P>0.05),利用Reparixin单药干预U937细胞后可下调CXCR1、CXCR2、CXCR4 mRNA的表达(P<0.05),其中CXCR2表达相较对照组及其他CXCR家族受体表达下调水平更为显著(P<0.01);当Reparixin与Ara-C联合干预时,CXCR1、CXCR2下调水平较单药组更为显著(P<0.01),而CXCR4、CXCR7 mRNA表达较单药组无显著差异(P>0.05)。结论:Reparixin联合Ara-C能协同抑制U937细胞增殖、侵袭、迁移和克隆形成等恶性生物学行为,并诱导其发生自噬与凋亡,其机制可能与影响Bcl-2家族蛋白表达并下调CXCR家族表达以及同时抑制PI3K/AKT/NF-кB信号通路有关。

器官移植术后淋巴组织增生性疾病的临床回顾性研究

移植术后淋巴组织增生性疾病(post-transplant lymphoproliferative disorders,PTLD)是一类临床罕见、缘于实体器官移植(solid organ transplant,SOT)或骨髓造血干细胞移植(hemapoietic stem cell transplantation,HSCT)术后长期接受免疫抑制治疗而诱发的淋巴细胞或浆细胞恶性克隆性疾病,因发病部位不定,常为结外部位,且EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)在PTLD发生、发展中扮演着重要角色^([1])。

巢式MSP法检测急性白血病患者p16基因甲基化状态

为了研究p16基因甲基化和缺失与急性白血病发病的关系,探讨其在成人急性白血病发生发展中的生物学意义,应用巢式甲基化特异性聚合酶链反应(nested methylation specific polymerase chain reaction,n-MSP)分析了82例各种亚型的急性白血病患者在初诊或复发不同阶段p16基因的甲基化和缺失状态,并且在基因组硫化修饰PCR后克隆测序验证结果的准确性。结果表明:82例急性白血病(AL)患者p16基因甲基化的出现率为39.0%,其中急性髓系白血病(AML)患者为41.4%,24例急性淋巴细胞白血病(ALL)患者为33.3%;初治AL患者为36.6%,而复发患者则为54.5%。82例AL患者中有6例p16基因缺失,缺失率为7.3%,在AML、ALL患者中分别为1.7%和20.8%。16例健康自愿者或非恶性血液病患者p16基因则未发生甲基化或缺失。结论:在成人急性白血病的发生发展中,p16基因甲基化比p16基因纯合缺失更具有意义;p16基因表达异常与成人急性白血病的发生发展密切相关。

As_2O_3对Jurkat细胞株hdpr1基因去甲基化作用机制的研究

本研究探讨三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)对急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞株hdpr1抑癌基因去甲基化的影响及其作用机制。采用CCK8法检测As2O3对Jurkat细胞的增殖抑制作用,流式细胞术检测As2O3作用前后细胞周期的变化,甲基化特异性PCR(MSP)检测As2O3对hdpr1基因甲基化模式的影响,用半定量RT-PCR检测As2O3对hdpr1基因、DNA甲基转移酶基因dnmt1、dnmt3a、dnmt3b mRNA表达水平的影响。结果表明:As2O3可明显抑制Jurkat细胞的增殖并呈时间-浓度依赖性;As2O3阻滞Jurkat细胞周期于G0/G1期(p<0.05),呈浓度依赖性;As2O3能够逆转Jurkat细胞株hdpr1基因的高甲基化并诱导其mRNA重新表达,同时下调dnmt1、dnmt3a、dnmt3b mRNA的表达水平,亦呈浓度依赖性。结论:As2O3抑制Jurkat细胞的增殖,阻滞细胞周期于G0/G1期,其机制可能为下调dnmt1、dnmt3a、dnmt3b基因的表达,诱导Jurkat细胞中异常甲基化的hdpr1基因去甲基化并使其恢复表达。

AS_2O_3逆转人恶性淋巴瘤CA46细胞系p16基因甲基化状态及激活转录的实验研究

本研究旨在探讨三氧化二砷(As2O3)逆转恶性淋巴瘤CA46细胞株p16基因甲基化状态和调节转录作用及其可能的机制。以高甲基化的恶性淋巴瘤细胞株CA46作为研究基因甲基化与表达关系的实验对象。采用SRB法检测As2O3对人恶性淋巴瘤CA46细胞系增殖、活力的影响;nMSP法检测药物作用后p16甲基化状态变化;RT-PCR法检测p16、甲基转移酶DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA的表达;利用流式细胞术DNA倍体分析法探讨As2O3对恶性淋巴瘤细胞周期的影响。结果表明:①As2O3作用CA46细胞株72小时后p16基因甲基化程度明显减弱,p16基因异常甲基化的现象被逆转;②未处理组细胞p16基因呈微弱表达,As2O3作用72小时后p16基因表达增强,0.5μmol/L组、1.0μmol/L组和2.0μmol/L组p16基因表达阳性条带与β-actin灰度的比值分别为(0.33±0.10)、(0.57±0.11)、(0.67±0.09),阳性对照灰度比值为(0.73±0.13),差异有统计学意义(p<0.01);③与未处理组相比,As2O3作用72小时后甲基转移酶DNMT3A、DNMT3B的表达下降并呈浓度依赖性,而DNMT1表达不受影响;④与对照组相比,3组不同浓度As2O3均能明显抑制肿瘤细胞生长,G0/G1期细胞增加。结论:As2O3可能通过抑制甲基转移酶DNMT3A、DNMT3B或(和)直接逆转p16基因甲基化状态,使p16基因表达上调,并恢复其活性,从而实现其细胞周期调控功能,将细胞阻滞于G0/G1期,抑制肿瘤细胞的增长。

丙戊酸钠抑制人多发性骨髓瘤U266细胞增殖及组蛋白乙酰化调控的研究

本研究探讨丙戊酸钠(valproic acid sodium,VPA)对U266细胞增殖的抑制作用及对组蛋白乙酰化修饰调控的影响。采用CCK-8法检测VPA对U266细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测VPA作用前后U266细胞周期的变化,半定量RT-PCR检测VPA作用后U266细胞中组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)mRNA的表达变化,Western blot方法检测VPA作用后HDAC1及组蛋白H3、H4乙酰化蛋白水平的变化。结果表明,VPA对U266细胞增殖的抑制作用呈时间-浓度依赖性;2.5mmol/L的VPA处理细胞48小时后,细胞周期检测显示G0/G1期细胞比例增高,S期细胞比例下降,细胞被阻滞在G0/G1期(p<0.05);RT-PCR证实VPA能够抑制HDAC1 mRNA的表达水平;Western blot方法证实不同浓度VPA作用细胞48小时后HDAC1蛋白水平降低,组蛋白H3、H4乙酰化表达水平提高。结论:VPA能够抑制U266细胞增殖,使细胞阻滞于G0/G1期,这可能与VPA抑制HDAC1表达,上调组蛋白H3、H4乙酰化水平有关。

雷公藤内酯醇逆转人恶性淋巴瘤CA46细胞系p16基因甲基化的实验研究

目的:以p16基因存在异常甲基化的恶性淋巴瘤细胞CA46为研究对象,探究雷公藤内酯醇(triptolide,TPL)对P16这一细胞周期调控中的重要基因的影响,并对其机制进行初步探讨。方法:①运用四甲基偶氮唑盐(MTT)法等检测triptolide对CA46细胞株增殖的影响。②巢式甲基特异性PCR检测triptolide对CA46细胞p16基因甲基化模式的影响。③半定量RT-PCR检测经triptolide作用后CA46细胞p16基因mRNA的表达。结果:Triptolide对CA46细胞生长有明显的抑制作用,并有时间及剂量依赖性,48小时IC50为28.8ng/ml;triptolide可逆转P16基因的高甲基化;triptolide能够诱导CA46细胞p16基因mRNA的表达,具剂量依赖性。结论:小剂量triptolide可明显抑制CA46细胞的增殖,其可能机制为通过诱导CA46细胞中异常甲基化的p16基因去甲基化,使p16基因恢复表达,从而对细胞周期起负调控作用。

Stathmin1在急性白血病中的表达及意义

本研究探讨stathmin1基因和蛋白在急性白血病初治、复发和缓解患者中的表达及其意义。应用FQ-PCR和Western blot检测25例正常人和76例急性白血病患者外周血细胞中stathmin1 mRNA和stathmin1蛋白的表达水平。结果显示,在正常人体内检测不出stathmin1蛋白表达,其mRNA在正常人体内则低水平表达。急性白血病初治患者stathmin1 mRNA表达高于正常人(P<0.05),急性白血病复发者stathmin1 mRNA表达显著高于初治者(P<0.05),急性髓系白血病与急性淋巴细胞白血病之间stathmin1 mRNA表达无显著差别(P>0.05)。急性白血病初治患者stathmin1蛋白表达的阳性率为89%,stathmin1蛋白在急性白血病患者缓解后表达明显下降或不表达,急性白血病复发者stathmin1蛋白表达与初治者无显著差别(P>0.05),急性髓系白血病与急性淋巴细胞白血病之间stathmin1蛋白表达无显著差别(P>0.05)。结论:stathmin1蛋白和mRNA在急性白血病初治及复发患者体内高表达,而在缓解后体内仍有弱表达的患者,具有一定的复发风险,因此stathmin1可能成为判断微残留白血病的一个新的生物学指标。

SU11248干预白血病细胞HL-60对P27^KIP1和cyclin G蛋白表达的影响

目的:探讨SU11248对人髓系白血病细胞株HL-60的效应及其对HL-60细胞表达P27KIP1和cyclin G蛋白改变的影响。方法:应用MTT法检测SU11248对HL-60细胞增殖能力的影响;采用Western blot检测SU11248干预HL-60细胞前后P27KIP1和cyclin G蛋白表达水平的变化及其相关性。结果:不同浓度(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mg/L)SU11248作用HL-60细胞24h、48h、72h、96h后,SU11248可抑制HL-60细胞增殖,抑制作用呈现剂量和时间依赖性,半数抑制浓度(IC50)约为2.0mg/L。2.0mg/LSU11248作用HL-60细胞72h时抑制率达到最高。2.0mg/LSU11248作用HL-60细胞后cyclin G蛋白表达呈时间依赖性降低,而P27KIP1蛋白表达呈时间依赖性升高。两蛋白各时间组的改变与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:SU11248具有抑制HL-60细胞增殖的生物效应,在HL-60细胞及SU11248干预HL-60细胞过程中,P27KIP1基因可能对cyclin G基因及细胞周期发挥负性调控作用。SU11248通过上P27KIP1、下调cyclin G而干扰细胞周期可能是其发挥抑制肿瘤细胞分裂的环节之一。

SU11248对骨髓瘤细胞U266增殖及凋亡作用的实验研究

目的:探讨SU11248对骨髓瘤细胞U266的生物学效应的影响及其作用机制。方法:应用MTT法检测SU11248对U266细胞增殖能力的影响;用流式细胞技术检测细胞的DNA倍体及细胞周期变化、用凝胶电泳分析DNA片段化、用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测SU11248对U266细胞凋亡的影响;以RT-PCR法检测3.0μg/mlSU11248作用U266细胞后c-myc、hTERT、Bcl-2、BaxmRNA表达变化。结果:SU11248可明显抑制U266细胞增殖(P<0.05),呈现剂量和时间依赖性,半数抑制浓度(IC50)约为3.0μg/ml。SU11248可将U266细胞阻滞于G0/G1期,并呈现剂量依赖性;能诱导U266细胞呈现典型的DNA梯状带;促进细胞原位凋亡。3.0μg/mlSU11248作用后,U266细胞c-myc、hTERT、Bcl-2mRNA表达水平呈时间依赖性降低,而BaxmRNA表达水平呈时间依赖性增强。结论:SU11248能抑制U266细胞增殖,诱导其凋亡,其作用机制可能与下调U266细胞Bcl-2、c-myc和hTERT的表达及上调Bax的表达有关。